.png)
.jpg)
分子生物学实验指导
主编：于冰 马春泉 高传军 杨峰山
主审：李海英
黑龙江大学生命科学学院
2006 年 3月
目 录
绪论 分子生物学实验清静注重事项及分子生物学实验室所需要的仪器装备 ……………………………………………1
实验一 植物基因组DNA的疏散 ………………………………6
实验二 RNA的疏散 ……………………………………………11
实验三 DNA/RNA的琼脂糖凝胶检测…………………………15
实验四 DNA/RNA浓度、纯度的测定及浓度的调解…………21
实验五 聚合酶链式反应（PCR）………………………………24
实验六 随机扩增多态性DNA反应（RAPD）…………………28
实验七 甜菜M14品系AFLP剖析………………………………32
实验八 生物信息学………………………………………………49
前 言
黑龙江大学生命科学学院自建设以来，相继建设了生物工程专业，生物手艺专业，生物制药专业和食物科学与工程专业。分子生物学是一门二十一世纪的前沿学科，而实验操作是分子生物学的一个主要组成部分。我们团结了我院现有的仪器装备及质料情形，为本科生设立了八个分子生物学实验项目（包括一个综合性实验项目） ，以使学生掌握分子生物学领域中最基本的实验手艺。本书编写充分思量了实验的系列操作性，好比从基因组DNA、总RNA的提取到琼脂糖凝胶检测，从DNA浓度的调解到PCR手艺，从分子标记手艺到生物信息学剖析等，完全贯串了分子生物学的基本实验手艺。对生命科学学院的本科生来说是一本很好的实验课本。
绪论 分子生物学实验清静注重事项及分子生物学
实验室所需要的仪器装备
一、清静事项
在实验室中清静是最主要的，分子生物学实验经常与毒性强，甚至致癌的试剂接触，以是进入分子生物学实验室的职员，必需相识所有的清静步伐，并将实验室的操作置于最清静的条件下。下面提到的几点须特殊注重：
1．有毒的化学试剂
许多溶剂，像氯仿、异戊醇、异丁醇、正丁醇、甲醛和乙醚，应在透风橱中使用，并注重掩护衣服、皮肤和呼吸道。另一些试剂有可能是致癌物或诱变剂，像溴乙锭、甲酰胺，焦碳酸二乙酯（DEPC）等，在操作中应注重防护，并注重使用后的处置惩罚。种种试剂在使用前都应认真看一下使用说明，特殊是对一些试剂盒，掌握有关知识后，方可使用。
2．放射性
有些实验需要使用32P或其它放射性物质，在实验中要确实包管遵守使用这类物质的所有守则；对放射性放弃物也要同样小心。
3．生物学管制
虽然现代生物手艺领域的生长已经带来了重大的社会和经济效益，生物手艺所具有的巨鼎实力也给人类社会带来了许多意想不到的攻击，它既可以造福人类，也可能用来制造致命的生物武器，破损整小我私家类社会的清静。1976年6月30日，美国国家卫生研究院制订并正式宣布了“重组DNA研究准则”，划定榨取若干类型的重组DNA举行实验外，还制订了许多详细的条文划定。这些划定主要包括对生物体的物理防护和生物防护。物理防护主要是：实验室必需有手艺熟练的事情职员，具有准确的物理防护装备，如负压装置，高压灭菌及清静操作箱等等。生物防护主要包括选择非病原的生物体作外源DNA的克隆工具，或者对微生物举行细腻的遗传操作，减低其在情形中存活和滋生的可能性。
4．装备方面的危险
实验室内所有装备都有潜在的危险，操作要领不准确，就会泛起意外，以是实验室中的所有仪器的使用都应在先生的指导下举行，或者阅读本仪器的使用说明书后，方可使用。
二、分子生物学实验室所需要的仪器装备
1．灭菌
在分子生物学实验中，许多溶液、玻璃器皿和微量移液器枪头都要高压灭菌，特殊是在做RNA有关实验时，更需要干热及湿热高压灭菌，以去除RNA酶，电热干燥箱主要用于干热灭菌；而高压灭菌锅主要用于高压湿热灭菌。
2．离心机
险些每个分子生物学实验都要用到离心机，一个分子生物学实验室至少需要4台离心机，划分为一台低速（20000r/min）冷冻离心机、一台超速（20000-80000r/min）离心机、一台可离心1.5mL微量离心管的微型（MINI）离心机、一台大容量、低速率的离心机用来收获大宗的细菌作育液。
3．冷冻装备
至少需要一台通俗冰箱（4℃，-20℃），若有条件，还需要一台-80℃冰箱。许多动物、植物、微生物的样本以及试剂的贮存需要在低温或者超低温下贮存。
制冰机也是很须要的，由于许多反应是在冰上举行的。
4．光学丈量
紫外/可见分光光度计主要用来检测DNA/RNA的浓度和纯度，有条件的实验室用DNA/RNA盘算器来取代分光光度计，使用起来更利便。
5．天平
剖析天平和制备天平，天平的精度要抵达千分之一或者万分之一。
6．盘算机和打印机
主要用来举行RAPD等实验的聚类剖析及其他软件剖析。
7．凝胶电泳装置
至少有一套可知足差别分子量巨细的水平电泳槽和电泳仪，关于从事大规模测序的研究职员需要配备一套测序凝胶装置。还应有一套用于聚丙烯酰胺卵白质凝胶的笔直电泳仪及电泳槽，凭证需要，配备一套用于双向卵白质凝胶的特制电泳仪。
8．恒温箱（37℃）
用于作育细菌
9．温控摇床
用于作育液的作育
10．磁力搅拌器（最好带加热功效）
主要用于试剂的配制
11．微波炉
用于熔化琼脂和琼脂糖
12．PH计（酸度计）
试剂配制
13．0.1 μL - 5000 μL 规模的微量移液器
一样平常都为可调移液器,可调规模划分为0.1 μL—2.5 μL 、5 μL—10 μL、10 μL —100 μL、20 μL—200 μL 、100 μL—1000 μL、1000 μL—5000 μL
14．PCR仪（热循环仪）
用于PCR扩增反应
15．组织光照作育箱
用于组织作育
16．紫外视察仪
紫外视察凝胶板
17．旋涡混淆器（Vortex）
混淆微量试剂
18．水浴装置
至少需要两台水浴，DNA的提取及许多反应都要在水浴中举行。
19．纯水仪
分子生物学所用水均为纯水，水的电阻率要抵达MΩ级
20．玻璃器皿及塑料制品
巨细烧杯、烧瓶、试剂瓶、量筒、吸管、搅拌棒、研磨器、离心管（1.5mL、0.5mL）、PCR管、移液器枪头（Tip）等
21．响应的分子生物学试剂及试剂盒
三、一些常用细密仪器的使用要领
1． 微量移液器的使用要领
以Eppendorf型微量移液器为例实物解说
2． 冷冻离心机的使用要领
以 Beckman Microfuge R型冷冻离心机为例实物解说
3． PCR仪的使用要领
以PE9700型PCR仪为例实物解说
4．纯水仪的使用要领
以MiLLi-Q型纯水仪为例实物解说
四、思索题
1． 分子生物学实验中要注重的清静事项有哪些 ？
2． 微量移液器的准确使用要领。
实验一 植物基因组DNA的疏散
一、相关知识
疏散植物DNA是分子生物学实验的一个基本要求。差别的研究目的对DNA的纯度和量的要求不尽相同。例如，在构建用于筛选植物基因或其他诸如RFLP这样的遗传标记基因组DNA文库时，需要使用高相对分子质量、高纯度的DNA；而在举行遗传剖析时，对DNA的纯度要求就可以低一些。
一样平常而言，一个好的DNA疏散程序应切合以下三个主要标准：（1）所得DNA的纯度应知足下游操作的要求，用于RFLP剖析的DNA，其纯度的要求为可用限制性内切酶完全酶解并可乐成地转移到膜上举行Southern杂交；用于PCR剖析的DNA则不应含滋扰PCR反应的污染物；（2）所得DNA应当完整，电泳检查时可给出准确性高、重复性好的迁徙带型；（3）所得的DNA应有足够的量。
若是对植物举行大规模筛选，还应当知足操作程序应当快速、轻盈、价钱低廉，并尽可能阻止使用有毒试剂这样的要求。
二、实验原理
植物DNA的提取程序应包括以下几项：首先，必需破损（或消化）细胞壁以释放出细胞内溶物。疏散总基因组DNA常用的破壁要领是将植物组织胀水，然后研磨成细粉；或者将新鲜植物组织在干冰或液氮中快速冷冻后，用研钵将其磨成粉沫。
其次，必需破损细胞膜使DNA释放到提取缓冲液中，这一办法通� ？恐钊�SDS或CTAB一类的去污剂来完成。去污剂还可以掩护DNA免受内源核酸酶的降解。通常提取缓冲液中还包括EDTA，它可以螯合大大都核酸酶所需的辅助因子——镁离子。
最后，一旦DNA释放出来，其剪切破损的水平必需要降到最低。强烈振荡或Tip头小孔快速抽吸都会打断溶液中高相对分子质量的DNA。
疏散高相对分子质量的DNA还只是事情的一部分。由于在粗提物中往往含有大宗RNA、卵白质、多糖等杂质，这些杂质有时很难从DNA中除去。大大都卵白可通过氯仿或苯酚处置惩罚后变性、沉淀除去，绝大部分RNA则可通过经处置惩罚过的RNase除去。但多糖类杂质一样平常较难去除，这些杂质浓度高时，往往用一些DNA纯化试剂盒来进一步纯化DNA。
三、实验要领
1．向10 mL离心管中加入5 mL的2×CTAB（十六烷基三乙基溴化铵），60℃生涯预热，预热后加入10 μL 0.2%的巯基乙醇, 巯基乙醇的作用为抗氧化剂。
2．用液氮将研棒、研钵预冷，将0.5-1.5 g叶片放入研钵，捣碎成粉末，转移到①中的离心管中，轻轻转动离心管，使植物组织在提取缓冲中匀称疏散,置于60℃水浴摇床中保温30min。
3．加入等量5 mL氯仿，于空气摇床中摇15min，使管内混淆物成乳浊液，此时卵白质充分接触氯仿与核酸脱离，室温4000rpm离心15min分相，含卵白质胞碎片的有机相位于管的下面，上层为含核酸的水相。
4．离心后，用去头的Tip（怕破损DNA长链）将上清液转移到新的离心管中，将2/3量即3.3 mL预冷的异丙醇与之缓慢混匀，20℃，8000rpm离心10mim，沉淀DNA。
5．移去上清液，干燥后（用无菌操作台透风干燥）加1 mL TE消融沉淀。
6．加入5 μL RNase（10mg/mL）37℃保温45min，以去除DNA中的RNA。
7．加入等量（1 mL）苯酚—氯仿—异戊醇（25:24:1）,室温空气摇床徐徐混匀10 min,室温下4000rpm离心10min，进一步去除卵白质,用去头的200 μL Tip将上清转移到一支新的离心管中。
8．加入1/2量（0.5 mL）苯酚—氯仿—异戊醇（25:24:1）,摇床缓慢混匀10min，4000rpm离心10min，将上清转移到新的离心管中。
9．加入等量（0.8-1 mL）氯仿，摇床摇匀10min，4000rpm离心10min，将上清液移到新管中,这一步可除去水相中残留的酚。
10．加入1/10量（0.1 mL）3M NaAc，2.5倍量（2.5mL）冷乙醇，缓慢混匀，DNA沉淀析出，4000rpm离心10min。
11．弃去上清，干燥30-60min，加入0.5-1mL TE ，4℃消融并生涯。
四、实验要点
1．CTAB溶液在低于15℃时会析出沉淀，因此在将其加入冷冻的植物质料中之前必需预热。
2．在最适条件下，DNA—CTAB沉淀呈白色纤维状，很容易一下子就从溶液中钩出。不过，某些植物种的DNA沉淀中可能含有杂质，特殊是多糖，使DNA沉淀呈絮状或胶状，这种情形下可能需要稍事离心才华获得DNA?—CTAB沉淀。
3．饱和酚虽然可有用地使卵白质变性,但酚不可完全抑制RNA酶的活性,并且酚可以消融含poLy(A)的mRNA。若是用苯酚和氯仿的混淆液，可减轻这两种征象，同时可加入适量的异戊醇（苯酚—氯仿—异戊醇=25:24:1），异戊醇的作用是消泡，并使卵白质层细密，使水相和有机相分层较好。
五、所需仪器、耗材
1．1.5mL离心管
2．60℃水浴，37℃水浴
3．研钵、研棒
4．空气摇床
5．冷冻离心机
6．超净事情台
7．冰箱
8．去头的10 μL Tip
9．去头的200 μL Tip
10．吸水纸
11．液氮罐
六、所需试剂
1．CTAB（十六烷基三乙基溴化铵）
2．巯基乙醇
3．液氮
4．氯仿
5．冷异丙醇
6．TE缓冲液
7．RNase
8．苯酚—氯仿—异戊醇（25:24:1）
9．3M NaAC
10．冷乙醇
七、试剂配制
1．1M Tris—HCl，pH=8.0
Tris—HCl:121.1g 60.55g
浓 HCl :42mL 21mL
加H2O至 : 1L 500mL
→高压灭菌15min
2．0.5M EDTA Na2·2H2O，pH=8.0
EDTA Na2·2H2O :186.1g 93.05g 55.83g
加H2O水至 : 1L 500mL 300mL
用NaOH调pH=8.0（约需20g NaOH颗粒）
→高压灭菌
3．2×CTAB
40.9g NaCl；10gCTAB，50mL 1MTris-HCl（pH=8.0）
20mL 0.5M EDTA（pH8.0）定容至500mL，高压灭菌。
4．TE缓冲液
1M Tris-HCl 5mL+ 0.5M EDTA 1mL→加水定容至500mL，高压灭菌。
5．3M NaAC（pH=5.2）
在200mL水中消融102g三水乙酸钠，用冰乙酸调理pH值至5.2，加水定容至250mL，高压灭菌。
6．0.2% 巯基乙醇
100mL水中加入0.2mL巯基乙醇。
7．20×SSC
NaCl :175.3g 87.65g
柠檬酸钠 :88.2g 44.1g
10N NaOH :数滴调pH=7.0
ddH2O :1L 500mL
8．10mg/mL RNase A
取10mg RNaseA溶于1mL 2×SSC（0.1mL 20×SSC定容至1mL）中，滚水煮10分钟，冷却，分装-20℃生涯。
八、思索题
1．提取缓冲液中CTAB或EDTA的作用是什么 ？
2．怎样去除DNA杂质中的卵白质和RNA ？
3．纯化DNA办法中，苯酚、氯仿、异戊醇各有什么作用 ？为何交替使用 ？
实验二 RNA的疏散
一、RNA和无RNA酶的情形
在植物细胞中保存差别类型的RNA。rRNA占总RNA的70%;tRNA在细胞中的含量也较富厚（15%），mRNA含量为细胞总RNA的1-5%,大大都真核细胞mRNA在其3'端均有一多聚A(Poly A)尾巴。
在举行RNA操作时，需要特殊注重RNA被RNA酶降解。由于RNA酶保存于所有的生物中，并且RNA酶是一种耐受性很强的酶，古板的高温灭菌的要领不可使之失活。RNA酶的污染既可能源自内部，在植物的某些组织如根中RNA酶含量特殊高，也可能源自外部，如玻璃器皿，缓冲液和操作者的皮肤。其中人的皮肤外貌有大宗的RNA酶。以是应尽可能在无RNA酶的情形下举行有关RNA操作,详细步伐如下：
1．疏散RNA以前，将所用玻璃制品及取样铰剪、镊子等置于烤箱在300℃下烧烤4h或180℃烘烤8h以灭菌。
2．应用焦碳酸二乙酯处置惩罚过的水（DEPC-SDW）举行溶液的配制，并高压灭菌20min。DEPC是RNA酶的强烈抑制剂。DEPC-SDW配制如下：
100mL水中加入0.2mL DEPC原液，放于摇床上充分混匀并在室温下作用数小时，然后高压灭菌15min。
3．所用的Tip、离心管、PCR管等塑料制品都用0.05% DEPC-H2O处置惩罚：灌满DEPC-H2O，37℃安排2小时，用DEPC-SDW冲洗 ，并于100℃干烤15分钟并高压灭菌15分钟。
4．人的汗液中含有RNA酶，故在所有办法中均应戴手套并经常替换，通常使用的实验室装备诸如移液吸管等应浸泡于酒精中，使用前晾干。
二、实验原理
总RNA提取接纳一步法举行（TRIzoL试剂），试剂中有酚、胍和硫代氰酸盐，是由Chomczyanski和Sacchi生长的一种刷新的提取RNA的要领。在举行样品均质化和消融历程中，TRIzoL试剂可以可以破碎细胞，破损核卵白复合体，使RNA顺遂地解脱出来溶进缓冲液，同时TRIzol试剂可以坚持RNA的完整性。由于RNA在碱性条件下不稳固，因而在整个提取RNA历程中系统始终坚持酸性至中性，而在酸性条件下DNA少少爆发解离，DNA同卵白质一起变性后被离心下来，这时溶液分为液体相和组织相，RNA可以完整地生涯在液体相中。在提取液体相后，加入异丙醇来沉淀RNA，最后用75%乙醇来洗RNA。
三、实验要领
（一）均质化及分相
1．玻璃研磨器中放1mL TRIzol RNA提取液
2．冰上研磨
3．研磨液移入1.5mL离心管，室温安排5分钟。
4．加入0.2mL氯仿，盖好盖，用手（或vortex）强烈振动15秒。
5．再在室温下安排2-3分钟。
6．4℃条件下12000g离心15min，离心管中共分三相，上层为RNA液体相，中层为DNA及碎破组织相，下层为酚-氯仿相。
7．上清液RNA液体相移入新的离心管中。
（二）RNA沉淀
8．与0.5mL的异丙醇混匀后，室温安排10分钟（洗氯仿，沉淀RNA）。
9．4℃离心12000g 10分钟。
（三）洗涤
10．倒掉上清液后加入1mL的75%乙醇振荡（vortex）洗RNA（洗掉异丙醇）。
11．4℃条件下7500g离心5分钟。
（四）重溶RNA
12．去掉乙醇。
13．干燥10分钟。
14．用DEPC-SDW 50 μL消融RNA沉淀，可在55-60℃条件下温育10min。
15．加入3倍体积的无水乙醇（150 μL）放入-20℃或-80℃下生涯。
四、所需仪器、耗材
1．180℃烘箱
2．4℃离心机
3．玻璃研磨器
4．离心管
5．移液器
6．枪头
7．饭盒
8．滤纸
9．玻璃器皿
10．高压灭菌锅
11．沙布
12．一次性手套
13．水浴
14．vortex
15．白瓷盘
五、所需试剂
1．TRIzol试剂
2．氯仿
3．异丙醇
4．75%乙醇（用DEPC-SDW配制）
5．DEPC-H2O
六、思索题
1． TrizoL试剂在实验中的作用是什么 ？
2． 实验历程中，加入氯仿后，溶液共分为哪三相 ？
3． 怎样抵达尽可能的无RNA酶的情形 ？
实验三 DNA/RNA的琼脂糖凝胶检测
一、实验原理
疏散出细胞的总RNA或部分RNA之后，凭证它们响应的迁徙可以通过电泳区分RNA分子，是检测RNA分子是否降解的要害一步。
电泳是现在用于疏散和纯化DNA/RNA片断的最常用手艺。当制备好的一块“胶”即一块包括电解质的多孔支持介质并把它置于静电场中，DNA/RNA分子将向阳极移动，这是由于DNA/RNA分子沿其双螺旋骨架两侧带有富含负电荷的磷酸根残基。当DNA/RNA长度增添时，来自电场的驱动力和来自凝胶的阻力之间的比率就会降低，差别长度的DNA/RNA片断就会泛起差别的迁徙率。因而就可依据DNA/RNA分子的巨细使其疏散。
依据制备凝胶的质料，凝胶电泳可分成两个亚类：琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。聚丙烯酰胺疏散小片断DNA/RNA（5—500bp）****，其区分力极高，相差1bp的DNA片断就能脱离，其缺乏之处为制备和操作较为难题。琼脂糖凝胶的区分能力要比聚丙烯酰胺凝胶低，但其疏散规模较广。用种种浓度的琼脂糖凝胶可以疏散长度为200bp至近50kb的DNA/RNA片断。
（一）琼脂糖凝胶
1．琼脂糖浓度
接纳差别浓度的凝胶有可能区分规模普遍的DNA分子。
2．EB染料的保存
溴化乙锭（EB）是一种吖啶类染料，它在紫外灯照射下能发射荧光，当DNA样品在琼脂糖凝胶中电泳时，琼脂糖凝胶中的EB就插入DNA分子中形成荧光络合物，使DNA发射的荧光增强几十倍，电泳后就可直接紫外灯照射下检测琼脂糖中的DNA。
含差别量琼脂糖的凝胶的疏散规模
凝胶中的琼脂糖含量[%（W/V）] | DNA/RNA分子的疏散规模（kb） |
0.3 | 5—60 |
0.6 | 1—20 |
0.7 | 0.8—10 |
0.9 | 0.5—7 |
1.2 | 0.4—6 |
1.5 | 0.2—3 |
2.0 | 0.1—2 |
3．电泳缓冲液的组成
有几种差别的缓冲液可用于电泳，划分为 Tris—乙酸（TAE）、Tris—硼酸（TBE）或Tris—磷酸（TPE），其浓度约为50mmoL/L，PH为7.5—7.8,这些缓冲液均含有EDTA。这些缓冲液通常配制成浓缩液，贮存于室温。
常用的电泳缓冲液的配制
缓冲液 | 使用液 | 浓贮存液（每升） |
Tris—乙酸（TAE） | 1×：0.04moL/L Tris—乙酸 0.001moL/L EDTA | 50×：242g Tris碱 57.7mL 冰乙酸 100mL 0.5moL/L EDTA (PH8.0) |
Tris—磷酸（TPE） | 1×：0.09moL/L Tris—磷酸 0.002moL/L EDTA | 10×：108g Tris碱 15.5mL 85%磷酸 40mL 0.5moL/L EDTA(PH8.0) |
Tris—硼酸（TBE） | 0.5×0.045moL/L Tris—硼酸 0.001moL/L EDTA | 5×：54g Tris碱 27.5g硼酸 20mL 0.5moL/L EDTA(PH8.0) |
4．加样缓冲液：
缓冲液类型 | 6×缓冲液 | 贮存温度 |
I | 0.25%溴酚蓝 0.25%二甲苯青FF 40%（W/V）蔗糖水溶液 | 4℃ |
II | 0.25%溴酚蓝 0.25%二甲苯青FF 15%聚蔗糖水溶液 | 室温 |
III | 0.25%溴酚蓝 0.25%二甲苯青FF 30%甘油水溶液 | 4℃ |
IV | 0.25%溴酚蓝 40%（W/V蔗糖水溶液） | 4℃ |
V （碱性加样缓冲液） | 300m moL/L NaoH 6 mmoL/L EDTA 18%聚蔗糖水溶液 0．15%溴甲酚绿 0．25%二甲苯青FF |
4℃ |
加样缓冲液可以增大样品密度，以确保DNA匀称进入样品孔内，还可以使样品泛起颜色，从而使加样操作更为便当，溴酚蓝在琼脂糖凝胶中移动的速率约为二甲苯青FF的2.2倍, 溴酚蓝在琼脂糖凝胶中移动的速率约与长300bp的双链线性DNA相同,而二甲苯青FF在琼脂糖凝胶中移动的速率则与4kb双链线性DNA相同。选用哪一种加样缓冲液纯属小我私家喜恶。
5．DNA片断长度标记
DNA片断长度标记通常叫作 DNA Marker,本实验使用Gene RulerTM DNA Ladder Mix 为DNA片断长度标记，划分由100bp、200 bp、300 bp、400 bp、500 bp、600 bp、700 bp、800 bp、900 bp、1031 bp、1200 bp、1500 bp、2000 bp、2500 bp、3000 bp、3500 bp、4000 bp、5000 bp、6000 bp、8000 bp、10000 bp 组成，DNA Marker不但可以作为凝胶中DNA片断长度的一个标记，还可以作为电泳的比照。
二、实验要领
1．50×TAE的稀释：如制备50mL 1×TAE，取1mL 50×TAE加入49mL水定容至50mL。
2．制备1%的琼脂糖胶液：取0.2g琼脂糖溶于20mL TAE中，在短时间里加热琼脂糖所有熔化，使溶液冷却至60℃，加入浓度为10mg/mL的EB 2μL，使EB的终浓度为1μg/mL。
3．用于RNA电泳的电泳槽用去污剂洗清洁，再用水冲洗，用乙醇干燥后灌满3% 的H2O2溶液，于室温安排10分钟，然后用DEPC—SDW冲洗电泳槽，梳子同样处置惩罚。
4．用胶带封住胶床，放好梳子。
5．将温热琼脂糖倒入胶床中，凝胶的厚度在3—5mm之间，凝固20—60min。
6．在凝胶完全凝固之后，小心移去梳子和胶带，将胶床放在电泳槽内，加样孔一侧靠近阴极（黑极）。
7．向电泳槽中注入适量的TAE缓冲液，通常缓冲液高于胶面1cm。
8．划分将RNA样品与加样缓冲液混淆，（10μL RNA样品+2μL 6×加样缓冲液），用移液枪将12μL样品加入加样孔。
9．准确毗连电泳槽和电源，设定稳压为75V，电流一样平常为50mA。
10．电泳竣事后，在紫外视察仪上举行视察，可以看到提取完整的RNA共有三条带，划分是5kb的28S rRNA, 2kb 18S rRNA及0.1—0.3kb的5S rRNA及tRNA，可以看到28S rRNA的含量约为18S rRNA含量的2倍，说明总RNA完整性优异，无降解。
三、注重事项
溴化乙锭溶液的净化处置惩罚：
溴化乙锭是强诱变剂，有中度毒性，可致癌，使用这一染料时务必戴上手套。
1．溴化乙锭浓溶液（浓度＞0.5mg/mL）的净化处置惩罚。
①加入足量的水使EB的浓度降低至0.5mg/mL以下。
②加入1倍体积的0.5moL/L KMnO4，小心混匀后再加1倍体积的2.5moL/L HCL，小心混匀，于室温安排数小时。
③加入1倍体积的2.5moL/L NaOH，小心混匀后可扬弃该溶液。
2．溴化乙锭稀溶液（如含0.5μg-1μg/mL溴化乙锭的电泳缓冲液）的净化处置惩罚。
①每100mL溶液中加入100mg粉状活性炭。
②于室温安排1小时，时时摇动。
③用滤纸过滤溶液，扬弃滤液。
④用塑料袋封装滤纸和活性炭，作为有害物予以扬弃。
四、所需仪器、耗材
1．电泳仪 6．微量移液器
2．电泳槽 7．紫外视察仪或紫外灯
3．天平 8．州玻璃器皿
4．磁力搅拌器 （烧杯、容量瓶及广口瓶种种规格）
5．酸度计 9．紫外防护镜
五、所需试剂
1． EDTA—Na2·2H2O （乙二胺四乙酸二钠盐）
2． 溴化乙锭（EB）
3． 琼脂糖
4． Tris （三羟基氨基甲烷）
5． 冰醋酸
6． 溴酚蓝
7． 蔗糖或甘油
8． 二甲苯青FF
六、试剂配制
1．加样缓冲液：（6×）IV型
0.25%溴酚蓝，40%（W/V）蔗糖水溶液
如配50mL，加入0.125g溴酚蓝，20g蔗糖，混匀，定容至50mL，4℃生涯。
2．TAE，50×浓缩贮存液：
Tris 242g，冰醋酸57.1mL，100mL 0.5moL/L EDTA, PH=8.0，加600mL水强烈搅拌，定容至1000mL。
3．0.5moL/L EDTA， PH=8.0
在800mL水中加入186.1g EDTA—Na2·2H2O，在磁力搅拌器上强烈搅拌，用NaOH调理溶液的PH值至8.0（EDTA—Na2·2H2O在溶液PH值靠近8.0时，才华完全消融），然后定容至1 L，分装后高压灭菌备用。
4．溴化乙锭贮存液（10mg/mL）：
在100mL水中加入1g溴化乙锭，用磁力搅拌器搅拌几个小时，然后转移至棕色瓶中，4℃贮存。
七、思索题
1． 加样缓冲液的作用是什么 ？
2． 琼脂糖中加入EB的作用是什么 ？
3． 电泳时，为什么DNA/RNA分子将向阳极移动 ？
实验四 DNA/RNA浓度、纯度的测定及浓度的调解
一、实验原理
在分子生物学实验中，提取DNA或RNA后，往往需要测定其纯度和浓度，在纯度抵达标准，浓度调解到所需浓度后，才华举行下一步实验。
有条件的实验室，使用DNA/RNA盘算器，能够很利便、很迅速地测定DNA/RNA浓度和纯度，但DNA/RNA盘算器往往很腾贵。一样平常实验室常使用紫外分光光度计来测定DNA/RNA的浓度。
1．关于DNA，凭证其在260、280、310nm下紫外吸收值A260、A280、A310，可确定其纯度和浓度。
关于dsDNA：1.0A260=50μg/mL
ssDNA：1.0A260=33μg/mL
纯DNA溶液的A260/280应为1.8±0.1，高于1.8则可能有RNA污染，低于1.8则有卵白质污染。
A310值是配景，若盐浓度较高，A310值也高。
2．关于RNA，凭证其在230、260、280nm下紫外吸收值A230、A260、A280，可确定其纯度和浓度。
1.0A260=40μg/mL
A260/A280应介于1.7~2.0之间
若是A260/280比值太小，说明可能RNA样品中污染了卵白或苯酚。A260/A230的比值应该大于2.0，不然就可能被异硫氰酸胍（TRizoL试剂因素）污染了。
二、实验要领
1．测定前，石英比色杯须用浓盐酸：甲醇=1：1溶液浸泡1小时，随后用DEPC-SDW彻底冲洗。
2．以实验三中最终提取的RNA样品为例。
原RNA样品中共有200μL水，向样品中加入2μL 3moL/L PH=5.2的乙酸钠溶液，使其终浓度为0.03moL/L，充分混淆举行沉淀，4℃ 12000g下离心5min，去上清液，用预冷的70%乙醇洗涤沉淀，晾干，然后用DEPC-SDW 20μL消融RNA。
3．用DEPC-SDW看待测样品做1：1000倍数稀释（2μL样品加入1.998 mL DEPC-SDW）。
4．划分测定样品的A260、A280及A230。
5．划分盘算样品A260/A280及A260/A230的比值。
三、所需仪器
1．离心机
2．微量移液枪
3．紫外分光光度计
四、所需试剂
1． 浓盐酸
2． 甲醇
3． 乙酸钠
4． DEPC-SDW
五、试剂配制
3moL/L 乙酸钠（PH5.2）250mL 溶液的配制：
在200mL DEPC-SDW中消融 102.025g三水乙酸钠，用冰乙酸调理PH值至5.2，加入25μL原溶液DEPC，然后定容至250mL，安排住宿，高压灭菌15min。
六、思索题
1． 怎样确定DNA或RNA溶液的浓度 ？
2． 凭证你所测得的DNA或RNA的浓度，试盘算若是把溶液浓度调理到0．1μg/μL应向溶液中加入几多μL的水 ？
