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             25mM dNTPS             1.6¦ÌL

          2£®5mM MgCl2           1.2¦ÌL

             Primer 1£¨10¦ÌM£©      0.8¦ÌL

             Primer 2£¨10¦ÌM£©      0.8¦ÌL

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          Taqø£¨5¦¬/¦ÌL£©        0.2¦ÌL

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       4£®Taq    DNA¾ÛºÏø£¨5¦¬/¦ÌL£©

       5. 10¡ÁPCR»º³åÒº

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       7£®¼ÓÑù»º³åÒº

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»ùÒò×éDNA£¨1mg/mL£©           2 ¦ÌL

ÏÞÖÆÐÔÄÚÇÐø                            1 ¦ÌL

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Pad1£º    5¡ä--CTC GTA GAC TGC GTA CAT GCA--3¡ä      

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Bam¢ñ£º

Bad1£º    5¡ä--GGG TCG AAT TCG AGC TCA G--3¡ä      

Bad2£º    3¡ä--CCC AGC TTA AGC TCG AGT CCT AG--5¡ä

2£®ÌÖÂÛµÄÖƱ¸£º

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3£®ÖƱ¸ÅþÁ¬·´Ó¦ÏµÍ³£º

È¡Ò»Ö§PCR¹Ü£¬±ùÉÏÒÀ´Î¼ÓÈëÏÂÁÐÒòËØ£º

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25¦ÌMÌÖÂÛ                   0.2 ¦ÌL

T4 Ligation Buffer               5 ¦ÌL

T4 Ligase£¨3U/¦ÌL£©           0.6 ¦ÌL

ddH2O                      39.2 ¦ÌL

×ÜÌå»ý                       50 ¦ÌL

4£®Îü´ò»ìÔÈ£¬16¡æÌõ¼þO/N£¬¾ÙÐÐÅþÁ¬·´Ó¦¡£

5£®¼Ó0.1¡ÁTE BufferÖÁÖÕÌå»ý250 ¦ÌL£¬4¡æÉúÑı¸Óá£

£¨Èý£©Ñ¡ÔñÐÔPCRÀ©Ôö

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Es2£º    3¡ä--GAC TGC GTA CCA ATT CAG C--5¡ä

Pst ¢ñ:

Ps1£º    5¡ä--GAC TGC GTA CAT GCA GCT G--3¡ä      

Ps2£º    3¡ä--GAC TGC GTA CAT GCA GAC C--5¡ä

Bam¢ñ:

Bs1£º    5¡ä--TTC GAG CTC AGG ATC CGT G--3¡ä      

Bs2£º    3¡ä--    GAG CTC AGG ATC CAC G--5¡ä

2£®Ñ¡ÔñÒýÎïµÄÖƱ¸£º

ʹÓÃǰƾ֤Ħ¶ûÊý½«ÒýÎïÅäÖƳÉÖÕŨ¶È66 ng/¦ÌL£¬±¸Óá£

3£®ÖƱ¸PCR·´Ó¦ÏµÍ³£º

È¡Ò»Ö§PCR¹Ü£¬±ùÉÏÒÀ´Î¼ÓÈëÏÂÁÐÒòËØ£º

10¡ÁPCR Buffer                   2.0 ¦ÌL

2.5 mM dNTP                    1.6 ¦ÌL

25  mM MgCl2                    1.2 ¦ÌL

Ñ¡ÔñÒýÎï                        1.0 ¦ÌL

TaKaRa Ex Taq£¨5U/¦ÌL£©          0.2 ¦ÌL

ÅþÁ¬Ä£°åDNA                   10.0 ¦ÌL

ddH2O                           4.0 ¦ÌL

×ÜÌå»ý                          20 ¦ÌL

4£®Îü´ò»ìÔÈ£¬ÀëÐÄÍøÂç¡£

5£®PCRÒÇÀ©Ôö£¬Ñ­»·³ÌÐòÈçÏ£º

        94¡æ£¬5 min

        94¡æ£¬30 sec

        68¡æ£¬30 sec£¨Ã¿¸öÑ­»·½µµÍ0.7¡æ£©    12 Cycles

        72¡æ£¬1 min

        94¡æ£¬30 sec

        56¡æ£¬30 sec      23 Cycles

        72¡æ£¬1 min

        72¡æ£¬5 min

        4¡æÉúÑÄ£¬Hold¡£

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5.5%

    5%

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    H2O             25.6mL

    26.1mL

    26.6mL

27.6mL

  40%±ûÏ©õ£°·       6mL

    5.5mL

    5mL

4mL

    5¡ÁTBE          8mL

    8mL

    8mL

8mL

   10%¹ýÁòËá°·      360¦ÌL

    360¦ÌL

    360¦ÌL

360¦ÌL

     TEMED          40¦ÌL

    40¦ÌL

40¦ÌL

40¦ÌL

 

5£®½«ÉÕ±­ÖеÄÈÜÒºÑØÏ·½µÄÏ𽺿òÖеij¤²£Á§ÒºÒ»²àµ¹ÈëÁ½¿é²£Á§°åµÄåÐÒ£´¦£¬×¢ÂúÖÁ¶¥²¿£¬ÈôÓÐÆøÅÝ£¬ÓÃһϸ°ô½«ÆäÇãÔþ¡£

6£®Á¬Ã¦²åÈëÊʵ±µÄÊá×Ó£¬Êá×ÓƽµÄÒ»²àÒª¿¿½ü³¤²£Á§°å¡£

7£®½«µçÓ¾²Û·´×ª¹ýÀ´£¬Ê¹ÁíÒ»¸öûÓйེµÄÏ𽺿ò´¦ÔÚÏ·½£¬ÓÃͬÑùÒªÁì¹à½º¡£

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16£®µ¹µôÀο¿Òº£¬ÓÃÈ¥Àë×ÓˮϴåªÄý½º3´Î£¬È»ºó·ÅÈëȾɫҺȾɫ10·ÖÖÓ¡£

17£®µ¹µôȾɫҺ£¬ÓÃÈ¥Àë×ÓˮϴåªÄý½º3´Î£¬È»ºó·ÅÈëÏÔÓ°ÒºÖÐÏÔÓ°10¡ª20·ÖÖÓ¡£

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19£®ÊÓ²ì¼Í¼£¬Ð§¹ûÆÊÎö¡£

ËÄ¡¢ÊµÑéÒªµã

1£®Ã¸ÇÐʱһÑùƽ³£µÄ¼ÓÑùÐò´ÎΪˮ¡¢buffer¡¢DNA£¬×îºó¼ÓøҺ¡£

2£®Ã¸Çз´Ó¦ÎªÎ¢Á¿²Ù×÷£¬TipÒª´ÓÈÜÒºÍâòÎüÊÕ£¬ÒÔ±ÜÃâTipÕ´È¥¹ý¶àÒºÌåÓëø£¬´ýÓõÄÄÚÇÐøҪ·ÅÔÚ±ùÔ¡ÄÚ£¬Óúó¸Ç½ô¸Ç×Ó£¬Á¬Ã¦·Å»Ø£­20¡æ±ùÏ䣬±ÜÃâÏÞÖÆÐÔÄÚÇÐøµÄʧ»î¡£

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5£®ÈôÓ¾µÀÖеÄDNAϵ´ø»ìÔÓ£¬¿ÉÄÜÊÇÓÉÓÚDNAÑùÆ·ÔÚ³õʼ»º³åÒºÖÐÖ»ÊDz¿·ÖÏûÈÚ»òÕßÊÇÓÉÓÚÒÒ´¼³ÁµíºóDNAÑùÆ·ÖÐÈÔÊ£ÓàÓÐÒÒ´¼¡£

6£®µçÓ¾Ìõ´øϲ¿½ÏÆäËû²¿Î»ÁÁµÃ¶à£¬Õâ¿ÉÄÜÊÇÓÉÓÚÑùÆ·ÖлìÓÐRNA»òDNAÑùÆ·±¬·¢Á˽µ½â¡£

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3£®Ë®Æ½µçÓ¾²Û                    4£®±ÊÖ±°åµçÓ¾²Û

5£®ÒÆҺǹ                        6£®¶³ÀäÀëÐÄ»ú

7£®×ÏÍâÊÓ²ìÒÇ                    8£®¸ßѹÃð¾ú¹ø

9£®×ÏÍâÄý½º³ÉÏñϵͳ              10£®´ÅÁ¦½Á°èÆ÷

11£®Ëá¶È¼Æ                       12£®µº½ò×ÏÍâ·Ö¹â¹â¶È¼Æ

13£®³¬µÍαùÏä                   14£®´¿Ë®ÒÇ

15£®µÍÎÂÑ­»·Ë®Ô¡¹ø               16£®³¬ËÙÀëÐÄ»ú

17£®±ùÏä                         18£®¹Ä·ç¸ÉÔïÏä

19£®À䶳¸ÉÔïÀëÐÄ»ú               20£®PCRÒÇ

21£®ÀëÐĹܠ                      22£®ÖÖÖÖϸ¿ÚÆ¿¼°ÉÕ±­

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Áù¡¢ËùÐèÊÔ¼Á

1£®»ùÒò×éDNA£¨1mg/mL£©    2£®·Ö×ÓÁ¿Marker

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5£®Ãð¾úÕôÁóË®£¨SDW£©       6£®ÏÞÖÆÐÔÄÚÇÐø¼°Ã¸Çз´Ó¦»º³åÒº

7£®3M  NaAC                8£®ÒÒ´¼

    9£®ÉÏÑù»º³åÒº                10¡¢Tris-HCl

11£®ÅðËá                     12£®EDTA£¨ÒÒ¶þ°·ËÄÒÒËᣩ

13£®¹ýÁòËá易                14£®TEMED£¨N-N-N¡¯-N¡¯-Ëļ׻ùÒÒ¶þ°·£©

15£®±ù´×Ëá                   16£®ÏõËáÒø

17£®ÇâÑõ»¯ÄÆ                 18£®¼×È©

19£®±ûÏ©õ£°·                 20£®¼×²æË«±ûÏ©õ£°·£¨Bis£©

Æß¡¢ÊÔ¼ÁÅäÖÆ

1£®5¡ÁTBE

               ÖÕÌå»ý1L                 ÖÕÌå»ý500mL

Tris-HCl           54g                    27g

 ÅðËá            27.5g                  13.75g

0.5moL/L   EDTA  

 (pH=8.0)         20mL                  10mL

2£®0.5moL/L EDTA£¨pH=8.0£©

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