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实验指导
目 录
实验一 分子生物学实验室常用仪器及使用要领
实验二 质粒DNA的提�。盍呀夥�
实验三 琼脂糖凝胶电泳
实验四 限制性内切核酸酶的酶切与判断
实验五 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
实验六 动物组织细胞基因组 DNA提取
实验七 DNA的定量
实验八 PCR基因扩增
实验九 琼脂糖凝胶电泳疏散与纯化目的DNA
实验十 DNA重组
实验十一 动物组织细胞总RNA的提取
实验一 分子生物学实验室常用仪器及使用
事实证实，在科学飞速生长的今天，无论从事哪个领域的研究，要想突破，除了有优异的理论基础外，更主要的是依赖于先进的手艺和优良的仪器装备以及优异的研究情形。一个标准的分子生物学实验室除了具有一样平常生物学实验室的通例仪器装备外，还具有一些特殊用途的仪器，这些仪器一样平常较细密，价钱腾贵。下面介绍这些仪器的使用要领和注重事项。
一、冷冻离心机
低温疏散手艺是分子生物学研究中必不可少的手段�；蚱系氖枭ⅰ⒚嘎寻椎某恋砗徒幽梢约捌渌镅返氖枭⒅票甘笛橹卸祭氩豢臀吕胄氖忠�，因此低温冷冻离心机成为分子生物学研究中必备的主要仪器。在海内，有多个厂家生产冷冻离心机，本实验室的高速冷冻离心机为GL-20G-Ⅱ型（上海安亭），落地式。配有角式转头：6×50ml、12×10ml和12×1.5ml。极限转速20000rpm。
1. 装置与调试
离心机应安排在水平结实的地面上，应至少距离10cm以上且具有优异的透风情形中，周围空气应呈中性，且无导电性灰尘、易燃气体和侵蚀性气体，情形温度应在0～30℃之间，相对湿度小于80%。试转前应先翻开盖门，用手盘动转轴，轻盈无邪，无异常征象方可上所用的转头。转子准确到位后翻开电源开关，然后用手按住门开关，再按运转键，转动后连忙阻止，并视察转轴的转向，若逆时针旋转即为准确，机械可投入使用。
2. 操作程序
（1）插上电源，待机指示灯亮；翻开电源开关，调速与准时系统的数码管显示的闪灼数字为机械事情转速的出厂设定，温控系统的数码管显示此时离心腔的温度。
（2）设定机械的事情参数，如事情温度，运转时间，事情转速等。
（3）将预先平衡好的样品安排于转头样品架上，关闭机盖。
（4）按控制面板的运转键，离心机最先运转。在预先设定的加速时间内，其运速升 至预先设定的值。
（5）在预先设定的运转时间内（不包括减速时间），离心机最先减速，其转速在预先设定的减速时间内降至零。
（6）按控制面板上的阻止键，数码管显示dedT，数秒钟后即显示闪灼的转速值，这时机械已准备好下一次事情。
3. 注重事项
（1）离心机应始终处于水平位置，外接电源系统的电压要匹配，并要求有优异的接地线，机械不使用，要拔掉电源插头。
（2）开机前应检查转头装置是否牢靠，机腔中有无异物掉入。
（3）样品应预先平衡，使用离心筒离心时离心筒与样品应同时平衡。
（4）挥发性或侵蚀性液体离心时，应使用带盖的离心管，并确保液体不过漏以免侵蚀机腔或造成事故。
（5）除事情温度、运转速率和运转时间外，不要随意更改机械的事情参数，以免影响机械性能。转速设定不得凌驾最高转速，以确�；登寰苍俗�。
（6）使用中如泛起0.00或其它数字，机械不运转，应关机断电，10秒钟后重新开机，待所设转速显示后，再按运转键，机械将照常运转。
（7）不得在机械运转历程中或转子未停稳的情形下翻开盖门，以免爆发事故。
（8）每次操作完毕应做好使用情形纪录，并按期对机械各项性能举行磨练。
二、电泳仪
电泳手艺是分子生物学研究不可缺氨赡主要手段。电泳一样平常分为自由界面电泳和区带电泳大类，自由界面电泳不需支持物，如等速电泳、密度梯度电泳及显微电泳等，这类电泳现在已很少使用。区带电泳需用种种类型的物质作为支持物，常用的支持物有滤纸、醋酸纤维薄膜、非凝胶性支持物、凝胶性支持物及硅胶―G薄层等，分子生物学实验中最常用的是琼脂糖凝胶电泳。应用电泳法可以对差别物质举行定性或定量剖析，或将一定混淆物举行组份剖析或单个组份提取制备。下面以DYY-12型电脑三恒多用电泳仪（北京六一仪器厂）为例介绍其使用要领。
1.使用要领
（1）按电源开关，显示屏泛起“接待使用DYY-12型电脑三恒多用电泳仪…”等字样后，同时系统初始化，蜂鸣4声，设置常设置。屏幕转成参数设置状态，见图一：
U: 0V U＝ 100V ｜ Mode： STD
I: 0mA I ＝ 50mA ｜
P: 0W P＝ 50W ｜
T: 00:00 T＝ 01:00 ｜
其中:左侧大写U: I: P: T: 为电泳时现实值；中心部分显示程序的常设值（预置值）。Mode(模式)：STD(标准)；TIME(准时)；VH（伏时）；STEP（分步）
（2）设置事情程序。用键盘输入新的事情程序。例如，要求事情电压U＝1000V，电流I限制在200mA以内，功率W限制在100W以内，时间T为3小时20分，并且到时间自动关掉输出。则操作办法如下：
①按“模式”键，将事情模式由标准（STD）转为准时（TIME）
模式。每按一下模式键，其事情方法按下列顺序改变： STD?TIME?VH?STEP?STD。
②先设置电压U，按“选择”键，先将其反显，然后输入数字键即可设置该参数的数值。按数字1000,则电压即设置完成。
③设置电流I，按“选择”键，先使I反显，然后输入数字200。
④设置功率P，按“选择”键，先使P反显，然后输入数字100。
⑤设置时间T，按“选择”键，先使T反显，然后输入数字320。若是输入过失，可以按“扫除”键，再重新输入。
⑥确认各参数无误后，按“启动”键，启动电泳仪输出程序。在显示屏状态栏中显示Start! 并蜂鸣4声，提醒操作者电泳仪将输出高电压，注重清静。之后逐渐将输出电压加至设置值。同时在状态栏中显示“Run”，并有两个一直闪灼的高压符号，体现端口已有电压输出。在状态栏最下方，显示现实的事情时间（准确到秒）。
⑦每次启动输出时，仪器自动将此时的设置数值存入“MO”号存储单位。以后需要挪用时可以按“读取”键，再按“0”键，按“确定”键，即可将上次设置的事情程序取出执行。
⑧电泳竣事，仪器显示：“END”，并一连蜂鸣提醒。此时按任一键可止鸣。
2.注重事项
(1)U、I、P三个参数的有用输入规模是：U：5～3000V；I： 4～400mA；P：4～400W.
(2)一样平常情形下，当No Load！时，首先应关机检查电极导线与电泳槽之间是否有接触不良的地方，可以用万用表的欧姆档逐段丈量。
(3)若是输出端接多个电泳槽，则仪器显示的电流数值为各槽电流之和，此时应选择稳压输出，以减小各槽的相互影响。
(4)注重坚持仪器的清洁，不要遮挡仪器后方进风通道。严禁将电泳槽放在仪器顶部，阻止缓冲液洒进仪器内部。
(5)本仪器输出电压较高，使用中应不阻止接触输出回路及电泳槽内部，以免爆发危险。
(6）恒久不必仪器，应安排在干燥透风的清洁情形中生涯。
三、剖析天平
剖析天平是定量剖析事情中不可缺氨赡主要仪器，充分相识仪器性能及熟练掌握其使用要领，是获得可靠剖析效果的包管。剖析天平的种类许多，有通俗剖析天平、半自动/全自动电光剖析天平及电子剖析天一律。现在实验室通例备用的是自动化水平较高的电子剖析天平。下面介绍电子剖析天平 PL203/01型和AL104/01型 (METTLER-TOLEDO)的性能及使用要领。PL203/01型细密电子天平：最大称量210g；现实分度值0.001g；AL104/01型高区分率电子剖析天平：最大称量110g；现实分度值0.0001g
1. 使用要领
（1）检查并调解天平至水平位置。检查电源电压是否匹配（使用设置的稳压器），按天平仪器要求通电预热至所需时间30min 。
（2）翻开天平开关“on”，天平则自动举行迅速度及零点调理。待显示屏上所有字段短时点亮，天平回零时，可举行正式称量。
（3）称量时将清洁称量瓶或称量纸置于称盘上，关上侧门，天平将显示该重量，点击“?O/T?”键自动校对零，然后逐渐加入待称物质，直至所需重量为止。
（4）称量竣事应实时除去称量瓶（纸），关上侧门，切断电源，并做好使用情形挂号。
2. 注重事项
（1）天平应安排在牢靠平稳水泥台或木台上，室内要求清洁、干燥，同时应阻止光线直接照射到天平上。
（2）称量时应从侧门取放物质，读数时应关闭箱门以免空气流动引起天平摆动。
（3）挥发性、侵蚀性、强酸强碱类物质应盛于带盖称量瓶内称量，避免侵蚀天平。
（4）电子剖析天平若长时间不使用，则应准时通电预热，每周一次，每次预热2h，以确保仪器始终处于优异使用状态。
四、分光光度计
差别物质对差别波长入射的吸收水平各不相同，从而形成各具特征的吸收光谱 。凭证这一原理，应用比色法可以对某些有色物质举行定性或定量剖析。但由于比色法仅限于可见光区，并且精度低，已远远不可知足高精度微量剖析的要求。随着科学手艺一直生长，剖析仪器也一直地更新换代，人们引进了分光光度法的看法，分光光度计随之应用。分光光度计由光源、单色器、吸收池、接受器、显示屏幕所组成，它不但顺应于可见光区，同时还扩展至紫外光区及红外光区。光密度（OD）是许多溶液中的溶质定量的指标之一，通过所爆发的单色光而测定某一溶液对该单色光的吸收值。分子生物学实验中常使用紫外分光光度计举行核酸溶液定量和纯度的起源判断。下面介绍紫外可见光分光光度计GeneQantTM Pro（Amersham）的使用要领。该仪器除了能检测核酸样品浓度外，还可举行卵白质浓度以及细胞作育液浓度的测定，能检测低至几微升样品（70?l和5～7?l），样品无需稀释，丈量后还可所有接纳。
使用要领
(1）翻开电源开关（ON），期待数秒钟，显示屏上显示一系列数据，如本机型号、目今日期等，这些数据可以重新设置，当泛起“instrument Ready”即可进入下一程序。
(2）在仪器面板上有许多功效键，其中包括检测base sep 、Tm、DNA、RNA、oligo、Protein595assay、Protein280 meas、cell culture等。例如，欲检测DNA， 按DNA键，即进入DNA检测程序。在显示屏上：
Pathlengh 10mm
Units ?g/?l
Use 320nm NO
Dilution Faotor 1
Insert reference,
以上为仪器预设置的参考数据，若按“enter”键，和“select”键可以将以上的参数举行重新设定。
(3）取石英样品杯70?l或5～7?l ，容量巨细凭证需要。先用吸管吸高纯水入样品杯中，然后放入仪器上的样品槽中，放入时注重样品杯的光学面朝前方。
(4)按“set ref”键，举行空缺测试。显示屏上泛起一系列数据均“0.000”并提醒插入样品“Insert sample ”。将样品杯取出，吸干水分，稍干燥后，同样吸入待测样品，放入样品槽中举行测定。
(5）一个样品测定完毕，按“stop”键，返回“Instrument Ready”。
(6）取出样品杯，吸出样品，然后用高纯水洗一再，自然晾干。由于样品杯十分腾贵，使用时要小心操作。不可用手指拿样品杯的光学面，用后要实时洗涤，可用温水或稀盐酸，乙醇以至铬酸洗液（浓酸中浸泡不要凌驾15分钟），外貌只能用柔软的绒布或拭镜头纸擦净。
五、数字式酸度计
酸度计是实验室设置溶液必备的仪器。本实验室的酸度计为台式微电脑酸碱度计和温度计（Hanna）,丈量pH规模为0.00～14.00pH；温度为0.0～100.0℃；
1. 使用要领
（1）将pH电极和温度探头与主机毗连，主机与电源毗连。
（2）取出电极�；ぬ�，若是有结晶盐泛起，这是电极常见征象，浸入水后就会消逝。若是薄膜玻璃或透析膜发干，可在HI170300电极生涯液中浸泡1小时。
（3）pH校准。将pH电极和温度探棒浸泡在所选的标准缓冲液内4cm（建议用pH6.86、7.01），缓冲液值可通过“D℃”或“?℃”键来调理。按“CAL”键，仪器将显示“CAL”和“BUF”符号及“7.01”数据。当读数不稳固时，屏幕会显示“NOTREADY”；当读数稳固时，屏幕会显示“READY”和“CFM”，按“CFM”键确认校准值。确认第一校准点后，将pH电极与温度探棒浸泡在标准缓冲液内4cm（建议用pH4.01、9.18、10.01）；再按“CAL”键，仪器将显示“CAL”和“BUF”符号及“4.01”数据。按“CFM”键确认校正值。
（4）pH丈量。校准完毕后，仪器自动进入pH丈量状态，将电极与温度探棒浸泡在待测溶液约4cm，停几分钟让电极读数稳固。
2. 注重事项
（1）由于pH211酸度计内装有可充电电池，在刚购置或长时间安排后，再使用时，通电校正丈量完毕后，可将电源继续还插入电源插座，只需关闭开关，这样可以包管电池充电，是校正值得以贮存，下次丈量时无须校正即可进入准确丈量。
（2）不可用蒸馏水、去离子水和纯水浸泡电极。若是读数误差太大（±1pH），则是由于没有校正或电极变干。为阻止电极受损，在关机前要将pH电极从溶液中拿出。当处于关机状态时，在电极浸入电极生涯液前，电极要与机械脱离。
（3）如仪器已测过几种差别的样品溶液，请用自来水洗濯，或在插入样品溶液前，用待测样品洗濯电极。
（4）温度会影响pH的读数，为丈量准确的pH值，温度要在适合的规模内举行自动温度赔偿，用HI7669/2W温度探棒浸入样品中，紧靠电极并停几分钟，若是被测溶液的温度已知或丈量是在相同温度下举行，只需下手赔偿，那么此时温度探棒是不必毗连，屏幕上会显示温度读数伴有℃信号闪灼。温度可通过“?℃”或“D℃”来调理。
六、PCR仪
PCR仪，也称DNA热循环仪、基因扩增仪，它是使一对寡核苷酸引物团结到正负DNA链上的靶序列两侧，从而酶促合成拷贝数为百万倍的靶序列DNA片断，它的每一循环包括在三种差别温度举行DNA变性、引物复性、DNA聚合酶催化的延伸反应的三个历程。
PCR仪主要应用于基础研究和应用研究等许多领域，如基因剖析、序列剖析、进化剖析、临床诊断、法医学等等。随着分子生物学的一直生长，PCR扩增手艺也获得普及推广应用，因此相识PCR仪的性能，熟练掌握仪器的准确使用要领及使用历程中的注重事项，将是十分须要的。
现介绍PCR 扩增仪（Tl Thermocycler）的使用要领和注重事项。
1. 使用要领
(1）接通电源开关，仪器进入准备状态；在显示屏上纪录了目今仪器的温度和盖子（Lid）的温度。若仪器正在运行时，须按“ B ”键（start/stop），才华退出运行并返回准备状态。
(2）编写程序段。在准备状态下按“ C ”键(programs)进入编程状态，选定一程序号，然后按“enter”键，进入下一程序；按 “A”(list)键后，选一文件号（empty program）；再按“enter”键，进入下一程序；按“ABC”键，进入下一程序，用上下左右键号选择一个字母（A、B、C、D、…），然后按“enter”键，进入下一程序；按“name ok”键，完成文件命名。
(3）设定盖子的温度。“lid temp： ℃”，盖子的温度一样平常比变性温度要高10℃，例如变性温度是95℃，那么盖子的温度就要设定为105℃。待盖子预热后按“enter”键，进入下一程序。
(4）设定变性温度、变性时间、延伸温度、延伸时间、退火温度、退火时间及循环总数等参数。从第一步依次按“enter”键进入，用四个移位键移动设定位置。先设定温度，后设准时间，所有参数设置完后，按“pgm ok”键，所设定的程序自动被生涯。
(5）运行程序。检查设定是否准确， 按“start”键，选择设定好的程序，最先运行。显示屏上可视察到系统运行的情形，按“Stop”可阻止运行。
七、凝胶成像系统
本系统属全自动电脑控制影像剖析系统，主要拍摄核酸的agarose电泳胶片，及卵白质的acrylamide电泳胶片。在与markers较量后，可准确盘算样本的分子量，对核酸电泳也可准确定量，是分子生物学及生化卵白试验的主要检测工具。本系统包括暗箱，紫外透射仪，摄像头，变焦镜，电脑以及专业凝胶图象收罗及剖析.软件（3.3版）。该软件提供对电泳凝胶、黑点丈量、PCR密度的定量剖析等。别的，还提供图像收罗、标注、打印、数据和图像发送到Word、Excel、图像处置惩罚等功效。
1.使用要领
(1) 翻开电脑，启动凝胶剖析软件，进入用户界面。
（2）翻开收罗凝胶图像的暗箱装置电源开关，放入凝胶，翻开紫外光源或白光光源，将收罗装置与电脑上收罗卡相连，然后选择“文件”菜单中的“图像收罗”或工具栏的“图像收罗”按钮，泛起图像窗口：“最先收罗”、“阻止收罗”、“收罗图像”等。若是图像不清晰，可以调理暗箱上的变焦镜，使之清晰�？芍苯咏枷裆钠鹄�，也可通过“图像处置惩罚”对图像举行旋转、裁剪、滤波、调理比照度……方面的处置惩罚。
(3)对读入的电泳凝胶图像，可以启动电泳凝胶剖析系统。在“功效选择”菜单中选择“电泳凝胶”或在工具拦亓“电泳凝胶”工具，将泛起泳道剖析工具栏，并在“图像显示”子窗口中泛起一个红色的矩形框�；箍山搿疤醮饰觥毕低�，对条带 举行编号，对二条以上的条带举行较量。
（4）收罗图像竣事后，关闭暗箱电源开关，从暗箱中取出凝胶，并将玻璃板洗濯清洁，晾干。
八、空气恒温摇床
摇床（振荡器）为实验室的通例装备。SHK-99-Ⅱ型台式空气恒温摇床，接纳微电脑控制系统，温度规模：室温＋5℃～60℃，精度±0.5℃；时间规模：1分钟～99小时59分钟；转速规模：60RPM～250RPM。
1.使用要领
(1）LED屏幕上各段数据：
RPM Temp Time
1 000 00.0 00:00
屏幕上“1”体现第一段，若是是第二段则为“2”，“Temp”体现温度，“RPM”体现每分钟转速，“Time”体现时间，不设准时可自动累计时间一直运行。“Temp”、“RPM”、“Time”的值随时可以修改，随时按新值运行。
(2）事情程序设置。按“F1”键，进入设置状态�？稍谒俾�，温度，时间，运行等四部分之间切换。在每一部分按“F2”键输入数据，输入完十位数据，再输入个位数据，按“F2”键，再按“F2”键，到小数位，再按“F2”键，又到十位，以此循环。
(3）再按“F1”键，转回运行状态，按“Start”键，电机最先运行，时间最先计时。
(4）按“End”键，竣事系统运行。
2. 注重事项
（1）翻开电源，系统最先自检，期待LCD屏幕泛起“WELCOME”字样，系统自检完毕，可以举行第2步参数设置。若屏幕泛起：a.“TEMP ERROR”，体现温度检测线路有过失；b.“MOTOR ERROR”，体现电机部分有过失。
（2）运行历程可以翻开箱盖，这样电机不运行，时间也阻止，盖上盖接着运行。
（3）事情完毕，关闭电源。关机后，要等一段时间再开机。
九、水的净化妆置
分子生物学实验对水的纯度要求越来越高，一样平常蒸馏水经常难以知足实验要求，大多要求要举行第二次蒸馏（双蒸水），它可以去除水中的大部分有机杂质，但制作时间较长，并且无机杂质照旧许多。许多实验还需要去离子水，这就需要阴阳离子交流树脂举行处置惩罚。现在，分子生物学实验室都使用高质量的超纯水。如美国微孔滤膜公司的Milli-Q超纯水制造系统所制造的超纯水适用于许多学科领域，如分子克隆、种种色谱剖析、氨基酸剖析、DNA测序、酶反应、组织和细胞作育等实验。下面介绍RO-MB壁挂式反渗透高纯水机性能及使用要领。RO-MB反渗透高纯水机（杭州永洁达）产水量（25℃）10L/H；产水水质：RO纯水：<10μs/cm，高纯水：>15MΩ.cm；可用自来水制成通俗实验用水和高纯水，同时知足差别水质要求。在线电导率仪对产水水质一连检测，可包管产水质量。
1. 使用要领
(1)准备：先检测与纯水机相连的原水管路、废水管路毗连是否正常，翻开原水阀门。供电电源是否正常，检查按钮是否在关闭状态（按钮弹出状态）。将电源插头插入带有接地线的220V电源插座上。
(2）开机：依次按下电源开关，泵开关，纯水机启动产水，同时废水倾轧，指示灯亮起，并处于自动运行状态。
(3）取纯水：若翻开RO纯水或高纯水出口阀门，则可获得响应水质的纯水。当高纯水出口阀门翻开时，检测仪表显示高纯水电导率或电阻值。为了获得高质量的高纯水，可以先放掉一杯水后再取新鲜水。
(4）关机：不必时可关闭个按钮�；�，自来水进水阀门不必关闭，这时机子内部的进水电磁阀已自动切断水路。只要管路阀门不漏，也可使机子坚持自动待机状态。
2.注重事项
（1）纯水机的正常使用情形温度为15～35℃，产水量会随温度降低而下降，冬季保养温度不低于5℃。
（2）预处置惩罚滤芯一样平常三至六个月替换一次，现实使用寿命与自来水水质、总过滤量等有关。
（3）混床滤芯产高纯水约1～3吨，约二至四个月替换一次，现实使用寿命与自来水水质、水中含盐量、总用水量等有关。装备停运时间凌驾2天。必需注重按期冲洗维护。夏日宜天天开机30分钟冲洗一次，冬季每隔2～3天开机冲洗一次。
（4）使用历程若发明�；蟊萌云等缘孛扛羰种佑泄嬖虻仄舳胫佑滞；�，此为管路漏水引起，需实时翻开机箱加以解决。若每隔半小时以上启动数秒钟又�；�，乃属正常征象，有利于冲洗和�；し瓷改ぴ�，阻止遭到微生物滋生和镌汰污物沉积，尤其高温季节。
十、消毒装备
细菌和细胞作育以及核酸等有关实验所用的试剂、器皿及实验用具，应严酷灭菌，有的实验还要求没有核酸酶的污染，故应将实验器械，试剂等举行高压消毒。关于经由导入DNA重组分子的菌株，操作后必需举行严酷的高压消毒灭活处置惩罚。
大批实验物品、试剂、作育基等可以使用大型消毒器举行消毒。一些不可经受高压、高温消毒的试剂可用滤器滤膜除菌，器皿可用紫外线照射、75%乙醇或0.1%的十二烷基硫酸钠（SDS）浸泡消毒。所有的细胞作育、细菌作育的操作，都应在紫外线消毒后的超净事情台中举行。
下面介绍立式自动压力蒸汽灭菌器（LDZX-40BI）的使用要领。
1.使用要领
（1）开盖：转下手轮，使锅盖脱离密封圈。
（2）通电：毗连自动进水装置。接通电源，将控制面板上电源开关按至ON处，若水位低（LOW）红灯亮，蒸发锅内属断水状态；缺水（LACK）黄灯亮，电源已正常输入。
（3）加水：翻开水源，水位抵达低水位，控制面板上低水位红灯和缺水黄灯相继灭，加热（1-绿灯）亮，继续加水至高水位（HIGH）绿灯亮，自动阻止加水。
（4）堆放物品：需包扎的灭菌物品，体积不凌驾200mm×100mm×100mm为宜，各包装之间留有间隙，堆放在金属框内，这样有利于蒸汽的穿透，提高灭菌效果。
（5）密封高压锅：推横梁入立柱内，旋转手轮，使锅盖下压，充分压紧。
（6）设定温度：通电后数显窗灯亮，上层为红色，显示温度，下层为绿色，设定温度和时间。先按控制面板上确认键，绿色数显闪灼，进入温度设定状态。按一次移位键 所指响应位置闪灼，凭证所需数据位置举行（单项循环）移位。按△增添键或??镌汰键，举行所需温度设定。设定完毕，按二次确认键，举行温度确认。
（7）设准时间：按一次确认键，将温度设定切换成时间设定；再按一次移位键，所指响应位置闪灼，凭证所需数据位置举行移位；按增添键或镌汰键，举行所需时间设定。设定完毕，按二次确认键，举行时间设定确认。时间接纳倒计时，当灭菌锅内温度抵达设定温度，准时器最先倒计时。
（8）灭菌：在加热初，将下排汽阀翻开至笔直位置；下排汽阀待蒸汽冒出时，压力表显示指示为100℃时，将下排汽阀推向水平关闭位置；留有微量蒸汽逸出，以控制总汽流量的15%为宜。使用最高灭菌温度为124℃～126℃，压力在0.145Mpa～0.165Mpa规模内属于清静阀设定命，凌驾压力部分，清静阀将自动泄压，并最先计数灭菌所需时间。灭菌完成，电控装置将自动关闭加热系统，伴有蜂鸣提醒；并将保温时间切换成END显示；此时，将控制面板上电源开关按至OFF处；关闭电源，阻止加热待其冷却。
（9）干燥：物品灭菌后需要迅速干燥，须翻开放汽阀和下排汽阀，将灭菌器内的蒸汽迅速倾轧，使物品上残留水蒸汽快速挥发。
（10）将盖开启，取出已灭菌物品。关闭水源，翻开下排水阀，排尽灭菌室的水与水垢，以备下次使用。
2.注重事项
（1）堆放灭菌物品时，严禁梗塞清静阀的出汽孔，必需留出空位包管其空气流通，不然清静阀因出汽孔梗塞不可事情，造成事故。
（2）灭菌液体时，应将液体灌装在硬制的耐热玻璃瓶中，以不凌驾3/4体积为好，瓶口选用棉花纱塞，切勿使用未打孔的橡胶或软木塞，特殊注重，在灭菌液体竣事时禁绝连忙释放蒸汽，必需待压力表指针回零位方可排放余汽。
（3）对差别类型，差别灭菌物要求的物品，切勿放在一起灭菌，以免左支右绌，造成损失。
实验二 质粒DNA的提�。盍呀夥�
一、实验原理
细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，巨细规模从1kb至200kb以上不等。种种质粒都是保存于细胞质中、自力于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情形下可一连稳固地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通详尽胞破碎转达到子女。
一样平常疏散质粒DNA的要领都包括3个办法：①作育细菌，使质粒DNA大宗扩增；②网络和裂解细菌；③疏散和纯化质粒DNA。疏散制备质粒DNA的要领许多，其中常用的要领有碱裂解法、煮沸法、SDS法、羟基磷灰石层析法等。在现实操作中可以凭证宿主菌株类型、质粒分子巨细、碱基组成和结构等特点以及质粒DNA的用途举行选择。本实验介绍碱裂解法提取质粒DNA。
碱裂解法提取质粒DNA是凭证共价闭合环状质粒DNA和线性染色体DNA在拓扑学上的差别来疏散质粒DNA。在pH值介于12.0-12.5这个狭窄的规模内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，只管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链相相互互盘绕，仍会细密地团结在一起。当加入pH4.8乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，由于共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍坚持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链相互已完全脱离，复性就不会那么迅速而准确，它们相互纠葛形成不溶性网状结构，而复性的质粒DNA恢回复来构型，坚持可溶性状态。通过离心，染色体DNA与不稳固的大分子RNA，卵白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去，最后用酚氯仿抽提纯化上清液中的质粒DNA。
二、仪器及试剂
1.仪器及耗材：37℃恒温摇床、冷冻离心机、台式离心机、微量移液器、50 ml离心管、1.5 ml离心管管、枪头、种种规格的量筒、接种环、试剂瓶、100 l或者250 ml三角瓶、玻棒等。
2.试剂及配制：
LB作育液的配制：
酵母浸提物 5.0 g；
胰卵白胨 10.0 g；
NaCl 10.0 g；
依次称量后加入800 ml去离子水后搅拌至完全消融，用5 mol/L NaOH（约0.2 ml）调理作育液的pH值至7.0。再加去离子水将溶液定容至总体积为1000 ml，10磅高压灭菌20 min，冷却后4℃生涯。
溶液 Ⅰ（GET缓冲液）： 25 mmol/LTris-HCl（pH8.0）, 10 mmol/L EDTA, 50 mmol/L 葡萄糖
配制：1000 ml
1 mol/L Tris-HCl（pH8.0） 25 ml
0.5 mol/L EDTA（pH8.0） 20 ml
20% Glucose（1.11mol/L） 45 ml
dH2O 910ml
将以上溶液混淆装瓶， 10磅高压灭菌20 min，冷却后4℃生涯。
溶液II（变性液）：200 mmol/L NaOH ， 1% SDS
配制： 500 ml
10% SDS 50 ml
2N NaOH 50 ml
取以上溶液，用灭菌去离子水定容至500 ml，充分混匀。室温生涯，此溶液生涯时间最好不凌驾一个月，最好现用现配。
注重：SDS易爆发气泡，不要强烈搅拌。
溶液 III (醋酸钾液)：3 mol/L 醋酸钾（KAc）缓冲液，pH 5.6。 5 mol/L 冰醋酸
配制：500 ml
醋酸钾 147 g
冰醋酸 57.5 ml
加入300 ml去离子水后搅拌消融。待醋酸钾消融后，再加去离子水将溶液定容至500 ml。高温高压灭菌后，4℃生涯。
10×TE缓冲液（pH 8.0）：100 mmol/L Tris-HCl, 10 mmol/L EDTA
配制：1000ml
1 mol/LTris-HCl 缓冲液(pH 8.0) 100ml
500 mmol/L EDTA (pH8.0) 20 ml
加入约800 ml的去离子水，匀称混淆。溶液定容至1 L。高温高压灭菌后，4℃生涯。
苯酚/氯仿/异戊醇(25 : 24 : 1)：将量取25 ml Tris-HCl（pH8.0）平衡苯酚，加入24 ml 氯仿和 1 ml 异戊醇，充分混淆后，移入棕色玻璃瓶中，4℃生涯。
其它试剂：TE（pH8.0）、异丙醇、氯仿/异戊醇（24:1）、无水乙醇、70％乙醇、氨卞青霉素贮存液（50 mg/ml）
三、操作办法
1.菌体的作育和收获
(1）将5～10 ml含有氨卞青霉素（AP）的LB作育基加入到容量为100ml的三角瓶中，然后接入一单菌落，并坚持通气优异，于37℃ 220 rpm振摇住宿作育（约16h）后可以再转接一次，于37℃ 220 rpm振摇作育3～4 h。
(2）吸收作育的菌液1.5 ml，转入1.5 ml的离心管中，用台式离心机以12000 rpm离心3 min。弃上清，将离心管倒置，使液体尽可能流尽。
2.质粒DNA提�。盍呀夥ǎ�
（1）加100 ul 溶液Ⅰ 重悬细菌沉淀，用枪奏乐直至混和匀称。
（2）加200 ul溶液 Ⅱ，盖紧管口，轻缓上下倒置离心管以混淆内容物。室温静置5 min（溶液变透明，粘稠）。
（3）加150 ul溶液 Ⅲ，稍微振荡混和10 sec，置冰上10 min (溶液泛起白色沉淀)。
（4）12000 rpm离心6 min，取上清液至另一离心管（弃沉淀）。
（5）加等量的酚/氯仿/异戊醇，旋涡混匀1 min，12000 r/min离心6min，取上清液至另一离心管。
（6）加1倍异丙醇，振荡混匀，静置10 min，12000 rpm离心6 min。弃上清液，将离心管倒置于吸水纸，将附于管壁的剩余液滴除净。
（7）加200 ul 70％乙醇洗涤沉淀物，台式离心机12000 rpm离心2 min，弃上清液，将沉淀在室温下晾干（或在50℃－60℃的烘箱中也可）。
（8）沉淀加20μl TE, 重复奏乐使质粒DNA充分消融，－20℃生涯。
四、常见问题及可能缘故原由
1.提取的质粒DNA不纯：变性不充分；要害办法反应时间过短；离心时间或速率不敷。
2.提取的质粒DNA呈涂布状：操作历程中用力过猛，行动过大；操作系统内有污染。
3.与染色体DNA疏散不全：变性历程不完全；试剂配制有问题（因素，浓度或pH）。
实验三 琼脂糖凝胶电泳
一、实验原理
琼脂糖凝胶电泳是疏散和纯化DNA 片断的常用手艺。把DNA样品加入到一块包括电解质的多孔支持介质（琼脂糖凝胶）的样品孔中，并置于静电场上。由于DNA分子的双螺旋骨架两侧带有含负电荷的磷酸根残基，因此在电场中向正极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁徙速率取决于分子筛效应。具有差别的相对分子质量的DNA片断泳动速率纷歧样，因而可依据DNA分子的巨细来使其疏散。凝胶电泳不但可疏散差别分子质量的DNA， 也可以疏散相对分子质量相同，而构型差别的DNA分子。在电泳历程中可以通过示踪染料或相对分子质量标准参照物和样品一起举行电泳而获得检测。相对分子质量标准参照物相对可以提供一个用于确定DNA片断巨细的标准。在凝胶中加入少量溴化乙锭(ethidium bromide, EB)，其分子可插入DNA的碱基之间，形成一种络合物，在254～365nm波长紫外光照射下，呈桔红色荧光，因此也可对疏散的DNA举行检测。
一样平常琼脂糖凝胶电泳适用于巨细在0.2kb～50kb规模内的DNA片断。本实验介绍琼脂糖凝胶的制备以及琼脂糖凝胶电泳在DNA片断疏散中的应用要领。
二、仪器及试剂
1.仪器及耗材：
水平电泳槽、电泳仪、凝胶成像剖析系统、微波炉、微量移液器、透明胶带、点样板或parafilm、100 ml或250 ml锥形瓶、量筒、吸头等。
2.试剂及配制：
50×TAE缓冲液的配制：2 mol/L Tris-乙酸，0.05 mol/L EDTA（pH 8.0）
配制1000 ml
Tris 242 g
冰乙酸 57.1 ml
0.5 mol/L EDTA 100 ml
加入600 ml去离子水后搅拌消融，将溶液定容至1 L后。高温高压灭菌，室温生涯。
1×TAE缓冲液的配制：
称量20 ml的50×TAE缓冲液，再加入980 ml的去离子水。
溴化乙啶贮存液：10 mg/ml 溴化乙啶
配制：100 ml
称取1 g溴化乙啶，置于100 ml烧杯中，加入80 ml去离子水后搅拌消融。将溶液定容至100 ml后，转移到棕色瓶中。室温生涯。
6×上样缓冲液：0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青FF，30%甘油。
配制：10 ml
溴酚蓝 25 mg
二甲苯青FF 25 mg
甘油 3 ml
用6×TAE缓冲液定溶至10 ml，分装成1 ml/管。-20℃生涯。
其它试剂：DNA样品、DNA Ladder 、琼脂糖、
三、操作办法
1. 制备1％琼脂糖凝胶(大胶用70ml，小胶用50ml)：称取0.7 g（0.5 g）琼脂糖置于锥形瓶中，加入70 ml（50ml）1×TAE，瓶口倒扣小烧杯。微波炉加热煮沸3次至琼脂糖所有融化，摇匀，即成1.0%琼脂糖凝胶液。
2. 胶板制备：取电泳槽内的有机玻璃内槽（制胶槽）洗清洁、晾干，放入制胶玻璃板。取透明胶带将玻璃板与内槽两头边沿封好，形成模子。将内槽置于水平位置，并在牢靠位置放好梳子。将冷却到65℃左右的琼脂糖凝胶液混匀小心地倒入内槽玻璃板上，使胶液缓慢睁开，直到整个玻璃板外貌形成匀称胶层。室温下静置直至凝胶完全凝固，笔直轻拔梳子，取下胶带，将凝胶及内槽放入电泳槽中。添加1×TAE电泳缓冲液至没过胶板为止。
3. 加样：在点样板或parafilm上混淆DNA样品和上样缓冲液，上样缓冲液的最终稀释倍数应不小于1X。用10 ul微量移液器划分将样品加入胶板的样品小槽内，每加完一个样品，应替换一个加样头，以防污染，加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面。（注重：加样前要先记下加样的顺序）。
4. 电泳：加样后的凝胶板连忙通电举行电泳，电压60－100V，样品由负极（玄色）向正极（红色）偏向移动。电压升高，琼脂糖凝胶的有用疏散规模降低。当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm处时，阻止电泳。
(5）电泳完毕后，取出凝胶，用含有0.5 ug/ml的溴化乙锭1×TAE溶液染色约20 min，再用清水漂洗10 min。
(6)视察照相：在紫外灯下视察，DNA保存则显示出红色荧光条带，接纳凝胶成像系统照相生涯。
四、常见问题及注重事项
1．配琼脂糖时应使其完全熔化后方可制胶。
2．琼脂糖凝胶易于破碎，操作时要轻缓。
3．电泳时应注重电源线路，预防触电。
4．溴化乙淀具有致癌作用，配制及使用时应带乳胶或一次性塑料手套。并在专门的实验室内使用。
5．紫外线对人体有损伤作用，开灯时间不宜太长，注重防护。
6．DNA带形状模糊：DNA加样过多；电压太高；凝胶中有气泡。
7．质粒DNA的保存形式有3种，①共价闭环DNA（cccDNA），常以超螺旋形式保存；②开环DNA（ocDNA），此种质粒DNA的两条链中有一条爆发一处或多处断裂，因此可以自由旋转从而消除张力，形成松懈的环状分子；③线状DNA，因质粒DNA的两条链在统一处断裂而造成。因此质粒DNA电泳的效果中有可能泛起三条泳带，它们的泳动速率为：cccDNA > 线状DNA > ocDNA。
实验四 限制性内切核酸酶的酶切与判断
一、实验原理
限制性内切酶是一类能识别双链DNA分子中特异核苷酸序列的DNA水解酶，主要保存于原核生物中。凭证限制酶的识别切割特征、催化条件及是否具有修饰酶活性可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大类。其中Ⅱ类酶在分子克隆和基因操作中最为有用，是常用的分子生物学工具酶。
限制性内切酶识别序列长度一样平常为4～8个呈回文序列的特异核苷酸对。一样平常情形下，识别序列越长，在统一DNA分子中识别位点泛起的频率就越小。许多限制性内切酶的酶切位点已被确定。例如EcoRl 酶的识别与切割序列为以下6个碱基对。
5′……GAATTC……3′
3′……CTT AAG…… 5′
EcoR I以奇异的方法识别并裂解这个顺序，形成两个5′突出最后：
和
……G AATTC……
……CTT AA G……
这些最后为互补的，即粘性最后，并可在毗连酶的催化下与由EcoR I爆发的其它分子最后相毗连。
限制性内切酶主要用于基因组DNA的片断化、重组DNA分子的构建与判断、载体中目的基因片断的疏散与接纳以及DNA分子物理图谱的构建等。凭证酶切目的和要求差别，可有单酶切、双酶切或部分酶切等差别方法。凭证酶切反应的体积差别，可分为小量酶切反应和大宗的酶切反应。小量酶切反应主要应用于质粒的酶切判断，体积为20 μl, 含0.2～1 μg DNA，大宗酶切反应用于制备目的基因片断，体积为50～100 μl，DNA用量在10～30ug。
本实验为EcoR I对证粒pUC18的小量酶切。 在质粒的双链环状DNA分子上有多个限制性内切核酸酶酶切位点。在用特定的限制性内切核酸酶对证粒举行酶切反应后，通�？山幽汕碇悄旱缬揪傩信卸厦盖行Ч�。
二、仪器与试剂
1.仪器：
水浴锅、离心管、移液器、吸头、 电泳装备等。
2.试剂：
质粒pUC18、EcoR I限制性内切核酸酶、内切酶反应缓冲液、琼脂糖、电泳缓冲液、6×上样缓冲液、溴化乙啶染液、无菌水等。
三、操作办法
1．限制性内切酶反应一样平常在灭菌的0.2或0.5ml PCR薄壁离心管中举行。
2. 酶切反应系统（10ul）：
酶解缓冲液（10×buffer） 1 ul
限制性内切酶 0.5 ul EcoR I(7.5U)
底物DNA（质粒） x ul（依质粒浓度而定）
灭菌ddH2O 加至10 ul
限制性内切酶最后加入，手弹混匀或用吸头轻轻上下吹吸，混匀后6000 r/min，离心15s。37℃水浴消化2h。
3.酶切完毕，取5ul酶切产品举行琼脂糖凝胶电泳，判断酶切反应效果，必需用DNA分子量标准物同时举行电泳以确定DNA片断的巨细。若是酶切不完全，可继续.酶解消化反应，或加入适量酶后继续反应。
5. 经电泳视察酶切反应完全后，将上述反应液置65℃水浴中10～15min，中止酶切反应，将剩余酶切产品生涯于?C20℃备用。
四、注重事项
1.限制性内切酶需生涯于-20℃，操作时应将酶坚持在冰浴中，阻止长时间置于高温中。
2. 限制性内切酶溶液通常含有50%甘油，加入反应管后，因密度较大，往往沉淀至溶液底部，以是要充分摇匀。
3. 加样时吸头笔直进入试剂管，阻止遇到管壁，每加完一样要换一个吸头，同时在已加的样品前做个记号以避免错加或漏加，阻止污染。
4. 酶（置于冰盒上）应最后加入，只管镌汰室温接触时机。加酶时吸头深入不可过深。
5. 酶解消化反应温度实时间凭证该酶使用说明书而定。
6. 注重酶的用量，加入的酶量按1-3U/ug DNA盘算，酶的体积应低于反应总体积的10%，以阻止酶液中甘油滋扰反应 。酶量过大（≥25U/ug DNA）时，有爆发所谓星号活性的可能，即在识别序列以外的位点举行切割。别的，反应系统中甘油的质量分数大于12%，以及缺少NACL和保存M等情形下，都有可能泛起星号活性。
五、相关问题
1.酶的生涯
差别的限制酶往往生涯在大致相似的缓冲液中，这种特定配方的缓冲液能使酶活性维持较长时间。常用的生涯缓冲液各组分作用如下：
Tris-HCl （7.4―7.8）： 维持稳固的pH规模。
50-100mmol/L NaCl或KCl：提供一定的离子强度。
0.1mmol/L EDTA： 络合掉能激活限制酶的镁离子。
1mmol/L DTT： �；っ阜肿由系幕乖曰�。
200-500ug/ml BSA： 牛血清白卵白提高溶液中卵白质的浓度，避免卵白质分子浓度过低而导致酶分子变性。
50%的甘油： 使酶液生涯于-20℃不至冻结。
1-5 g/L的Triton-100： 这是一种非离子型外貌活性剂，能避免卵白质分子的外貌变性作用。
2. 酶单位的界说
限制酶的单位通常界说为：1U的酶能在约50ul合适的反应缓冲系统中，在1h内完成酶切1ug的λDNA。确定限制酶单位的详细操作要领是划分向1ug的底物中加入一系列的酶（1U左右），当电泳视察到酶切片断的条带不再爆发转变时说明已作用完全，完全切割的最少酶量定为1U的酶量。
3. 限制酶的作用条件
限制酶切割DNA的反应中，酶切条件是实验乐成的主要因素，其中包括反应的温度、时间与反应的缓冲系统，除了这些条件外，DNA的纯度与浓度也会影响酶切效果，只有在准确选择酶反应条件时才华抵达**酶切效果。
（1）作用温度
早期的酶切反应都在37℃举行，这种要领虽然简朴、统一，但却不可抵达每个酶的最适反应温度。为了抵达**酶切的*****凭证所选用的酶确定所需要的反应温度。
（2）缓冲系统
限制酶反应的缓冲系统大致相同，都含有以下组分：约100mmol/L的Tris-HCl，作用是将酶反应系统的pH维持在7.5-8.5；约10mmol/L的MgCl2，作用是为限制酶提供激活因子；1mmol/L的DTT，作用是�；せ乖曰�；约150mmol/L的NaCl，作用是提供合适的离子强度。由于熟悉的局限性，早期的限制酶反应系统仅凭证其中NaCl含量的差别分为高盐、中盐与低盐三种，这同样不可使每种酶获得最适反应条件。现在提供酶的许多厂商能提供4-10种缓冲系统，其中各必需因素之间只有很小的差别，目的是使每种酶都施展最大的作用。
缓冲液一样平常配成10倍的浓度，使用时以1/10的比例加入，虽然为了减小吸量误差也可自行配制5倍的缓冲液。
(3) 反应体积与时间
酶反应体积一样平常不宜小于20ul。由于过小的反应体积在加入种种因素时易爆发误差，甘油含量易凌驾10%。在37℃保温可因水分蒸发而显着改变反应系统中各因素的浓度，从而影响酶活力。同时还要思量反应完毕举行电泳时，所加样品中DNA的量能够在电泳中显出清晰的泳带。
通例的酶切反应一样平常控制在60min内举行，但也可以凭证切割工具与所用的酶将保温时间延伸至十几个小时。
(4) DNA的纯度与浓度
除了上述酶反应条件外，影响酶切效果的最主要因素是DNA的纯度。例如，样品中含有大宗RNA杂质时会因镌汰了酶的有用浓度而影响酶切效果；某些杂卵白未除净而团结在DNA时也会影响酶切效果。。至于抽提历程中未除净的种种影响因素就更多了，可能是微量的氯仿、SDS、EDTA、酚、EB、乙醇或是琼脂糖凝胶中的硫酸根离子等。
DNA纯度的另一个指标是不可含有微量的DNA酶。若是酶切后电泳效果显示出不清晰条带或成为一片红色（术语称Smear）时，可一定系统中已经污染了DNA酶。
DNA样品中含有大宗RNA时可用RNA酶处置惩罚；含有团结在DNA上的杂卵白与DNA酶时都可用氯仿/异戊醇抽提；当样品中含有氯仿、SDS、硫酸根等抑制酶切的小分子物质时可以通过沉淀替换一个新的缓冲系统。虽然，酶切失败时也不可扫除除DNA外的一切因素，如无菌水，EP管，吸咀等的清洁水平以及内切酶自身的酶活性情形。
除纯度外，DNA的浓度也会影响酶切效果，一样平常DNA质量浓度在1ug/20ul才华获得较好的酶切效果，质量浓度高达1.5ug/20ul时就可能爆发酶切难题。
(5)终止酶切反应的要领
若是需对酶切片断举行毗连或标记等操作时，首先要将限制酶灭活。灭活的要领可分为三种：第一种是向反应缓冲系统中加入终浓度为10-12.5mmol/L的EDTA，原理是络合掉酶反应中所需的镁离子。但这种要体会影响需镁离子的后续反应。以是一样平常加入EDTA后，要用乙醇沉淀法来替换缓冲系统，以除去EDTA，但这样就会造成DNA的损失。第二种要领是热失活：一样平常的酶如EcoRⅠ等在65℃保温60min即可；另一些酶如Hind Ⅲ等需在85℃保温30min方能抵达目的；极端的例子是Ttb Ⅲ甚至不可用加热的要领使之失活。热失活要领的特点是简朴并且未向系统中引入任何物质，特殊适用于一连举行几个酶切反应；热失活法的另一个特点是不必替换系统，以是不会造成DNA的损失。第三种要领是用酚和氯仿抽提使之失活，之后以乙醇沉淀DNA片断。这种要领的特点是处置惩罚条件强烈，能使酶彻底失活（不像第一种要领中酶卵白并未变性而只是没有激活因子罢了）。
