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Protein extraction and purification technology
Classification：Basic Knowledge and Application Release time：2019-05-11 13:06:07 Author: Source:

 选择质料及预处置惩罚

　　以卵白质和结构与功效为基础，从分子水平上熟悉生命征象，已经成为现代生物学生长的主要偏向，研究卵白质，首先要获得高度纯化并具有生物活性的目的物质。卵白质的制备事情涉及物理、化学和生物等各方面知识，但基来源理不过乎两方面。一是得用混淆物中几个组分分派率的差别，把它们分派到可用机械要领疏散的两个或几个物相中，如盐析，有机溶剂提取，层析和结晶等；二是将混淆物置于简单物相中，通过物理力场的作用使各组分分派于来同区域而抵达疏散目的，如电泳，超速离心，超滤等。在所有这些要领的应用中必需注重生涯生物大分子的完整性，避免酸、硷、高温，强烈机械作用而导致所提物质生物活性的损失。卵白质的制备一样平常分为以下四个阶段：选择质料和预处置惩罚，细胞的破碎及细胞器的疏散，提取和纯化，浓细、干燥和生涯。

　　微生物、植物和动物都可做为制备卵白质的原质料，所选用的质料主要依据实验目的来确定。关于微生物，应注重它的生恒久，在微生物的对数生恒久，酶和核酸的含量较高，可以获得高产量，以微生物为质料时有两种情形：（1）得用微生物菌体渗透到作育基中的代谢产品和胞外酶等；（2）使用菌体含有的生化物质，如卵白质、核酸和胞内酶等。植物质料必需经已往壳，脱脂并注重植物品种和生长发育状态差别，其中所含生物大分子的量转变很大，另外与季节性关系亲近。对动物组织，必需选择有用成份含量富厚的脏器组织为原质料，先举行绞碎、脱脂等处置惩罚。另外，对预处置惩罚好的质料，若不连忙举行实验，应冷冻生涯，关于易剖析的生物大分子应选用新鲜质料制备。

卵白质的疏散纯化

一，卵白质（包括酶）的提取

　　大部分卵白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液，少数与脂类团结的卵白质则溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中，因些，可接纳差别溶剂提取疏散和纯化卵白质及酶。

（一）水溶液提取法

　　稀盐缓和冲系统的水溶液对卵白质稳固性好、消融度大、是提取卵白质最常用的溶剂，通常用量是原质料体积的1-5倍，提取时需要匀称的搅拌，以利于卵白质的消融。提取的温度要视有用成份性子而定。一方面，大都卵白质的消融度随着温度的升高而增大，因此，温度高利于消融，缩短提取时间。但另一方面，温度升高会使卵白质变性失活，因此，基于这一点思量提取卵白质和酶时一样平常接纳低温（5度以下）操作。为了阻止卵白质提以历程中的降解，可加入卵白水解酶抑制剂（如二异丙基氟磷酸，碘乙酸等）。
下面着重讨论提取液的pH值和盐浓度的选择。
1、pH值
　　卵白质，酶是具有等电点的两性电解质，提取液的pH值应选择在偏离等电点两侧的pH 规模内。用稀酸或稀碱提取时，应避免过酸或过碱而引起卵白质可解离基团爆发转变，从而导致卵白质构象的不可逆转变，一样平常来说，碱性卵白质用偏酸性的提取液提取，而酸性卵白质用偏碱性的提取液。
2、盐浓度
　　稀浓度可增进卵白质的溶，称为盐溶作用。同时稀盐溶液因盐离子与卵白质部分团结，具有�；ぢ寻字什灰妆湫缘挠诺�，因此在提取液中加入少量NaCl等中性盐，一样平常以0.15摩尔。升浓度为宜�；撼逡撼＝幽�0.02-0.05M磷酸盐和碳酸盐等渗盐溶液。

（二）有机溶剂提取法

　　一些和脂质团结较量牢靠或分子中非极性侧链较多的卵白质和酶，不溶于水、稀盐溶液、稀酸或稀碱中，可用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂，它们具的一定的亲水性，尚有较强的亲脂性、是理想的提脂卵白的提取液。但必需在低温下操作。丁醇提取法对提取一些与脂质团结细密的卵白质和酶特殊优越，一是由于丁醇亲脂性强，特殊是消融磷脂的能力强；二是丁醇兼具亲水性，在消融度规模内（度为10%，40度为6.6%）不会引起酶的变性失活。另外，丁醇提取法的pH及温度选择规模较广，也适用于动植物及微生物质料。

二、卵白质的疏散纯化

卵白质的疏散纯化要领许多，主要有：

（一）凭证卵白质消融度差别的疏散要领

1、卵白质的盐析
　　中性盐对卵白质的消融度有显著影响，一样平常在低盐浓度下随着盐浓度升高，卵白质的消融度增添，此称盐溶；当盐浓度继续升高时，卵白质的消融度差别水平下降并先后析出，这种征象称盐析，将大宗盐加到卵白质溶液中，高浓度的盐离子（如硫酸铵的SO4和NH4)有很强的水化力，可争取卵白质分子的水化层，使之“失水”，于是卵白质胶粒凝聚并沉淀析出。盐析时若溶液pH在卵白质等电点则效果更好。由于种种卵白质分子颗粒巨细、亲水水平差别，故盐析所需的盐浓度也纷歧样，因此调理混淆卵白质溶液中的中性盐浓度可使种种卵白质分段沉淀。
　　影响盐析的因素有：（1）温度：除对温度敏感的卵白质在低温（4度）操作外，一样平常可在室温中举行。一样平常温度低卵白质溶介度降低。但有的卵白质（如血红卵白、肌红卵白、清卵白）在较高的温度（25度）比0度时消融度低，更容易盐析。（2）pH值：大大都卵白质在等电点时在浓盐溶液中的溶介度最低。（3）卵白质浓度：卵白质浓度高时，欲疏散的卵白质经常夹杂着其他卵白质地一起沉淀出来（共沉征象）。因此在盐析前血清要加等量心理盐水稀释，使卵白质含量在2.5-3.0%。
　　卵白质盐析常用的中性盐，主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。 其中应用最多的硫酸铵，它的优点是温度系数小而消融度大（25度时饱和溶液为4.1M，即767克/升；0度时饱和消融度为3.9M，即676克/升），在这一消融度规模内，许多卵白质和酶都可以盐析出来；另外硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好，不易引起卵白质变性。硫酸铵溶液的pH常在4.5-5.5之间，当用其他pH值举行盐析时，需用硫酸或氨水调理。
　　卵白质在用盐析沉淀疏散后，需要将卵白质中的盐除去，常用的步伐是透析，即把卵白质溶液装入秀析袋内（常用的是玻璃纸），用缓冲液举行透析，并一直的替换缓冲液，因透析所需时间较长，以是最幸亏低温中举行。别的也可用葡萄糖凝胶G-25或G-50过柱的步伐除盐，所用的时间就较量短。

2、等电点沉淀法 
　　卵白质在静电状态时颗粒之间的静电斥力最小，因而消融度也最小，种种卵白质的等电点有差别，可使用调理溶液的pH抵达某一卵白质的等电点使之沉淀，但此法很少单独使用，可与盐析法结适用。

3、低温有机溶剂沉淀法 
　　用与水可混溶的有机溶剂，甲醇，乙醇或丙酮，可使大都卵白质消融度降低并析出，此法区分力比盐析高，但卵白质较易变性，应在低温下举行。

（二）凭证卵白质分子巨细的差别的疏散要领

1、透析与超滤 
　　透析法是使用半透膜将分子巨细差别的卵白质脱离。
　　超滤法是使用高压力或离心力，强使水和其他小的溶质分子通过半透膜，而卵白质留在膜上，可选择差别孔径的泸膜截留差别分子量的卵白质。

2、凝胶过滤法 
　　也称分子排阻层析或分子筛层析，这是凭证分子巨细疏散卵白质混淆物最有用的要领之一。柱中最常用的填充质料是葡萄糖凝胶（Sephadex ged）和琼脂糖凝胶（agarose gel）。

（三）凭证卵白质带电性子举行疏散

卵白质在差别pH情形中带电性子和电荷数目差别，可将其脱离。

1、电泳法
　　种种卵白质在统一pH条件下，因分子量和电荷数目差别而在电场中的迁徙率差别而得以脱离。值得重视的是等电聚焦电泳，这是使用一种两性电解质作为载体，电泳时两性电解质形成一个由正极到负极逐渐增添的pH梯度，当带一定电荷的卵白质在其中泳动时，抵达各自等电点的pH位置就阻止，此法可用于剖析和制备种种卵白质。

2、离子交流层析法
　　离子交流剂有阳离子交流剂（如：羧甲基纤维素；CM-纤维素）和阴离子交流剂（二乙氨基乙基纤维素；DEAE?FONT FACE="宋体">纤维素），当被疏散的卵白质溶液流经离子交流层析柱时，带有与离子交流剂相反电荷的卵白质被吸附在离子交流剂上，随后用改变pH或离子强度步伐将吸附的卵白质洗脱下来。（详见层析手艺章）

（四）凭证配体特异性的疏散要领－亲和色谱法

　　亲和层析法（aflinity chromatography）是疏散卵白质的一种极为有用的要领，它经常只需经由一步处置惩罚即可使某种待提纯的卵白质从很重大的卵白质混淆物中疏散出来，并且纯度很高。这种要领是凭证某些卵白质与另一种称为配体(Ligand）的分子能特异而非共价地团结。其基来源理：卵白质在组织或细胞中是以重大的混淆物形式保存，每种类型的细胞都含有上千种差别的卵白质，因此卵白质的疏散（Separation），提纯（Purification）
和判断（Characterization）是生物化学中的主要的一部分，至今还没的单独或一套现成的要领能移把任何一种卵白质从重大的混淆卵白质中提取出来，因此往往接纳几种要领团结使用。

细胞的破碎

1、高速组织捣碎：将质料配成稀糊状液，安排于筒内约1/3体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速率。此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。

2、玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆往返研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎水平比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织。

3、超声波处置惩罚法：用一定功率的超声波处置惩罚细胞悬液，使细胞急剧震荡破碎，此法多适用于微生物质料，用大肠杆菌制备种种酶，常选用50-100毫克菌体/毫升浓度，在1KG至10KG频率下处置惩罚10-15分钟，此法的弱点是在处置惩罚历程会爆发大宗的热，应接纳响应降温步伐。对超声波敏感和核酸应慎用。

4、重复冻融法：将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，重复一再，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。

5、化学处置惩罚法：有些动物细胞，例如肿瘤细胞可接纳十二烷基磺酸钠（SDS）、去氧胆酸钠等细胞膜破损，细菌细胞壁较厚，可接纳溶菌酶处置惩罚效果更好。

　　无论用哪一种要领破碎组织细胞，都会使细胞内卵白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致自然物质量的镌汰，加入二异丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或减慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的卵白水解酶的活性，加入苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能扫除卵白水解酥活力，但不是所有，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取。

浓缩、干燥及生涯

一、样品的浓缩

　　生物大分子在制备历程中由于过柱纯化而样品变得很稀，为了生涯和判断的目的，往往需要举行浓缩。常用的浓缩要领的：
1、减压加温蒸发浓缩
　　通过降低液面压力使液体沸点降低，减压的真空度愈高，液体沸点降得愈低，蒸发愈快，此法适用于一些不耐热的生物大分子的浓缩。
2、空气流动蒸发浓缩 空气的流动可使液体加速蒸发,铺成薄层的溶液，外貌一直通过空气流；或将生物大分子溶液装入透析袋内置于冷室，用电扇瞄准吹风，使透过膜外的溶剂不沁蒸发，而抵达浓缩目的，此法浓缩速率慢，不适于大宗溶液的浓缩。
3、冰冻法 生物大分子在低温结成冰，盐类及生物大分子不进入冰内而留在液相中，操作时先将待浓缩的溶液冷却使之酿成固体，然后缓慢地融解，使用溶剂与溶质融点介点的差别而抵达除去大部分溶剂的目的。如卵白质和酶的盐溶液用此法浓缩时，不含卵白质和酶的纯冰结晶浮于液面，卵白质和酶则集中于下层溶液中，移去上层冰块，可得卵白质和酶的浓缩液。
4、吸收法 通过吸收剂直吸收除去溶液中溶液分子使之浓缩。所用的吸收剂必需与溶液不起化学反应，对生物大分子不吸附，易与溶液脱离。常用的吸收剂有聚乙二醇，聚乙稀吡咯酮、蔗糖和凝胶等，使用聚乙二醇吸收剂时，先将生物大分子溶液装入半透膜的袋里，外加聚乙二醇复盖置于4度下，袋内溶剂渗透即被聚乙二醇迅速吸去，聚乙二醇被水饱和后要替换新的直至抵达所需要的体积。
5、超滤法 超滤法是使用一种特别的薄膜对溶液中种种溶质分子举行选择性过滤的要领，不液体在一定压力下（氮气压或真空泵压）通过膜时，溶剂和小分子透过，大分子受阻保存，这是近年来生长起来的新要领，最适于生物大分子尤其是卵白质和酶的浓缩或脱盐，并具有本钱低，操作利便，条件温顺，能较好地坚持生物大分子的活性，接纳率高等优点。应用超滤法要害在于膜的选择，差别类型和规格的膜，水的流速，分子量阻止值（即概略上能被膜保存分子最小分子量值）等参数均差别，必需凭证事情需要来选用。另外，超滤装置形式，溶质成份及性子、溶液浓度等都对超滤效果的一定影响。Diaflo 超滤膜的分子量截留值：

膜名称

分子量截留值

孔的大的平均直径

XM－300

300，000

140

XM－200

100，000

55

XM－50

50，000

30

PM－30

30，000

22

UM－20

20，000

18

PM－10

10，000

15

UM－2

1，000

12

UM05

500

10

　　用上面的超滤膜制成空心的纤维管，将许多根这样的管拢成一束，管的两头与低离子强度的缓冲液相连，使缓冲液一直地在管中流动。然后将纤维管浸入待透析的卵白质溶液中。当缓冲液流过纤维管时，则小分子很易透过膜而扩散，大分子则不可。这就是纤维过滤秀析法，由于透析面积增大，因而使透析时间缩短10倍。

二、干燥

　　生物大分子制备获得产品，为避免变质，易于生涯，常需要干燥处置惩罚，最常用的要领是冷冻干燥和真空干燥。真空干燥适用于不耐高温，易于氧化物质的干燥和生涯，整个装置包括干燥器、冷凝器及真空干燥原理外，同时增添了温度因素。在相同压力下，水蒸汽压随温度下降而下降，故在低温低压下，冰很易升华为气体。操作时一样平常先将待干燥的液体冷冻到冰点以下使之酿成固体，然后在低温低压下将溶剂酿成气体而除去。此法干后的产品具有松散、消融度好、坚持自然结构等优点，适用于种种生物大分子的干燥生涯。

三、贮存

　　生物大分子的稳固性与生涯要领的很大关系。干燥的制品一样平常较量稳固，在低温情形下其活性可在数日甚至数年无显着转变，贮藏要求简朴，只要将干燥的样品置于干燥器内（内装有干燥剂）密封，坚持0－4度冰箱即可，液态贮藏时应注重以下几点。
1、样品不可太稀，必需浓缩到一定浓度才华封装贮藏，样品太稀易使生物大分子变性。
2、一样平常需加入防腐剂和稳固剂，常用的防腐剂有甲苯、苯甲酸、氯仿、百里酚等。卵白质和酶常用的稳固剂有硫酸铵糊、蔗糖、甘油等，如酶也可加入底物和辅酶以提高其稳固性。别的，钙、锌、硼酸等溶液对某些酶也有一定�；ぷ饔�。核酸大分子一样平常生涯在氯化钠或柠檬酸钠的标准缓冲液中。
3、贮藏温度要求低，大大都在0度左右冰箱生涯，有的则要求更低，应视差别物质而定。


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